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谢春雨
作品数:
5
被引量:10
H指数:2
供职机构:
青岛大学
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发文基金:
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相关领域:
医药卫生
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王芸
青岛大学医学院
曲彦
青岛大学医学院
胡丹
青岛大学医学院
张楠
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王奉涛
青岛大学
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谢春雨
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2017
1篇
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慢病毒介导的BAG-1L基因对缺氧状态下人神经母细胞瘤细胞的保护作用
被引量:1
2017年
目的探讨慢病毒介导Bcl-2结合抗凋亡基因1L(BAG-1L)过表达对缺氧/复氧诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用,研究其对磷酸肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法体外培养SH-SY5Y细胞,取对数生长期细胞分为重组慢病毒感染组(感染携带BAG-1L基因及荧光蛋白基因的重组慢病毒)、载体对照组(感染携带荧光蛋白基因但不携带BAG-1L基因的慢病毒)及细胞对照组(未感染慢病毒)。感染48h后采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测靶细胞BAG-1L的表达;3组细胞经缺氧8h/复氧24h处理后,采用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性;采用别藻蓝蛋白标记的膜联蛋白V/7-氨基放线菌素D(Annexin V-APC/7-AAD)双染法检测细胞凋亡,并进行流式分析;采用Western Blot试验检测细胞BAG-1L、热休克蛋白70(HSP70)、AKT及磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白表达。结果重组慢病毒感染48h后可观察到外源性BAG-1L特异性蛋白条带,而细胞对照组和载体对照组无此特异性蛋白条带。经缺氧,复氧处理后,重组慢病毒感染组细胞活性较细胞对照组和载体对照组均明显增高(A值:0.689±0.036比0.425±0.013、0.400±0.012),细胞凋亡明显减少[凋亡率:(26.97±1.82)%比(36.60±1.45)%、(35.77±3.74)%],BAG-1L、HSPT0、P-AKT蛋白表达水平明显升高(BAG-1L蛋白(灰度值):2.405±0.167比0.529±0.141、0.601±0.099,HSP70蛋白(灰度值):0.997±0.123比0.634±0.091、0.584±0.106,p-AKT蛋白(灰度值):1.234±0.118比0.661±0.210、0.712±0.199,均P〈0.01];而AKT蛋白表达虽高于细胞对照组和载体对照组(灰度值:1.103±0.269比0.646±0.188、0.791±0.326),但差异无统计学意义(均P〉O.05)。细胞对照组和载体对照组各指
王芸
李庆淑
贾超
谢春雨
宋砚坤
张楠
曲彦
关键词:
抗凋亡
P13K/AKT通路
慢病毒介导的热休克蛋白70基因对缺血/缺氧诱导嗜铬细胞瘤细胞内钙通道调节机制的研究
被引量:5
2016年
目的:探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)基因表达对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤(PC12)细胞内质网钙稳态的影响及钙通道的调节机制。方法取对数生长期的PC12细胞,分为重组慢病毒感染组〔感染含HSP70及绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒〕、慢病毒对照组(感染含GFP但不含HSP70基因的慢病毒)及未感染组。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测PC12细胞经缺血/缺氧处理4、8、12、24h后的细胞活性,以选取最佳缺血/缺氧时间。采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测缺血/缺氧8h时HSP70、肌质/内质网Ca2+-ATP酶亚型(SERCA2a、SERCA2b)、兰尼碱受体2(RyR2)、三磷酸肌醇受体1(IP3R1)的mRNA转录水平;采用蛋白质免疫印迹试验(WesternBlot)检测缺血/缺氧8h时HSP70、SERCA、IP3R的蛋白表达水平;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)及游离钙离子([Ca2+]i)水平。结果随着缺血/缺氧时间延长,各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势,均于8h时达峰值。缺血/缺氧8h时,重组慢病毒感染组细胞活性较未感染组和慢病毒对照组均明显升高〔A值(×10-2):20.3±2.2比14.1±2.1、15.0±1.6,均P<0.01〕,HSP70和SERCA的mRNA及蛋白表达均明显上调〔HSP70mRNA(2-ΔΔCt)为0.785±0.018比0.428±0.019、0.423±0.023,HSP70蛋白(灰度值)为2.72±0.20比1.56±0.36、1.63±0.41,SERCA2amRNA(2-ΔΔCt)为0.971±0.037比0.367±0.014、0.347±0.012,SERCA2bmRNA(2-ΔΔCt)为8.869±0.162比3.015±0.091、2.941±0.091,SERCA蛋白(灰度值)为2.84±0.18比1.48±0.26、1.52±0.29〕,IP3R2的mRNA及蛋白表达均明显下调〔IP3R2mRNA(2-ΔΔCt)为0.183±0.020比0.439±0.020、0.433±0.040,IP3R2蛋白(灰度值)为1.15±0.12比1.91±0.20、1.83±0.19〕,差异均有统计学意义(均P<0.01),而RyR1mRNA表达差异无统计学意义〔2-ΔΔCt(×10-3):1.97±0.63比2.02±0.22、2.01
刘媛
关纯
郭璐璐
李庆淑
王芸
谢春雨
胡丹
曲彦
关键词:
热休克蛋白70
PC12细胞
Bcl-2结合抗凋亡基因沉默对缺氧状态下人神经母细胞瘤细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响
被引量:5
2017年
目的探讨Bcl-2结合抗凋亡基因(BAG-1)对缺氧/再复氧损伤后人神经母细胞瘤细胞(SH—SY5Y)的保护作用,以及对热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法取对数生长期的SH—SY5Y细胞,采用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制BAG-1表达。将筛选好的细胞分为细胞对照组、慢病毒对照组(仅含荧光蛋白的慢病毒感染组)、BAG-1小干扰RNA(siRNA)组(即BAG-1基因沉默组,感染含BAG-1基因干扰序列及荧光蛋白的慢病毒),根据沉默序列不同分为BAG-1 siRNA—α组、BAG-1 siRNA-β组。感染重组慢病毒后72h采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测SH—SY5Y细胞中BAG-1和HSP70蛋白表达;缺氧处理后采用CCK-8测定各组细胞活性;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT—qPCR)检测各组细胞HSP70转录水平。结果慢病毒感染后72h,Western Blot检测结果表明BAG-1 siRNA—β组干扰效果优于BAG-1 siRNA-α组。各组细胞活性均随缺氧时间延长而呈先增强后减弱的趋势,且于8h时达峰值。经缺氧处理8h后,BAG—1 siRNA—β组细胞活性[吸光度(A)值]明显低于细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1 siRNA-α组(0.59±0.09比0.94±0.12、0.90±0.11、0.91±0.14,均P〈0.01);BAG—1 siRNA-β组凋亡细胞率明显高于细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1 siRNA-α组[(34.63±3.46)%比(14.83±3.75)%、(19.93±6.49)%、(16.40±1.18)%,均P〈0.01]。BAG-1 siRNA—β组HSP70蛋白及mRNA转录水平与细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1 siRNA-α组比较差异均无统计学意义(均P〉0.05)。结论BAG-1基因在缺氧神经细胞中能够发挥保护作用,减少细胞凋亡,其保护作用可以独立于HSP70基因。
宋砚坤
李智
王奉涛
刘海燕
曲彦
王芸
谢春雨
胡丹
关键词:
热休克蛋白70
细胞凋亡
HSP70沉默表达对缺氧状态下SH-SY5Y细胞凋亡的影响及机制研究
2017年
缺氧性脑病是人类死亡的重要原因,且发病呈逐年增高的趋势。虽然对缺氧性脑病的研究已涉及多方面,但因其发病机理复杂、部位特殊,仍无理想治疗药物。因此,寻求防治缺氧性脑病的方法已成为刻不容缓的任务。有研究表明,外源性HSP70表达可有效减轻神经元缺氧再复氧损伤的程度,但其作用机制尚不明确。本实验采用RNA干扰技术沉默HSP70,观察其对缺氧状态下神经细胞凋亡及BAG-1、Caspase-3、NF—κB表达的影响,进一步探讨HSP70在缺氧性脑病中的保护作用及机制。
谢春雨
谢伟峰
李庆淑
王芸
宋砚坤
张楠
胡丹
曲彦
关键词:
HSP70表达
缺氧状态
SH-SY5Y
缺氧性脑病
缺氧再复氧损伤
RNA干扰技术
HSP70沉默对缺氧诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的影响及机制研究
目的: 采用RNA干涉技术沉默神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)热休克蛋白70(HSP70)的表达,观察HSP70沉默对缺氧诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及BAG-1、NF-κB、caspase-3表达的影响。 方法...
谢春雨
关键词:
SH-SY5Y细胞
CASPASE-3蛋白
凋亡机制
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