牛楠
- 作品数：11 被引量：24H指数：4
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- NRF-1基因敲除增加CoCl2诱导的NRK-52E细胞凋亡
- 2020年
- 目的探讨核呼吸因子-1(NRF-1)对氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)诱导细胞凋亡的影响。方法采用CRISPR在线工具构建NRF-1-sgRNA,CRISPR/Cas9质粒酶切及T4连接酶的连接构建NRF-1基因敲除的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA,慢病毒包装后转染至NRK-52E细胞,通过嘌呤霉素筛选、流式细胞仪单选、T7E1酶切分析、Sanger测序及Western blot法检测NRF-1基因的表达水平;用含CoCl2(终浓度为600μmol·L-1)的完全培养液将NRF-1敲除组(mutant)、空载体组(vector)和正常对照组(control)细胞培养24 h后,用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,用Western blot法检测HIF-1a,Cleaved-caspase-3,Caspase-3,Bax,Bcl-2蛋白表达水平。结果测序结果显示NRF-1-sgRNA正确插入到lentiCRISPR质粒中,T7E1酶切分析显示,sgRNA2为NRF-1基因的有效靶点;Sanger测序结果证明NRF-1基因的9个碱基被敲除;与vector组比较,NRF-1敲除组(mutant1、mutant2、mutant3)组细胞株中NRF-1蛋白表达水平降低(P<0.01);CoCl2诱导缺氧时,mutant组细胞凋亡率高于vector组和contorl组(P均<0.01);当mutant组细胞与vector组比较时,HIF-1a、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平增高,Bcl-2蛋白表达水平降低(P均<0.01)。结论 NRF-1基因的敲除可以增加CoCl2诱导的大鼠肾细胞NRK-52E的凋亡水平。
- 董飞孙红丽牛楠李卉赵瑞王婵赵巍
- 关键词：氯化钴细胞凋亡
- 一种缺氧试验操作箱
- 本实用型设备属于实验操作箱技术领域，为一种缺氧试验操作箱，该仪器的主要构造为主操作仓一侧固定连接副操作仓，主操作仓与副操作仓中间活动连接有连接门，副操作仓顶端固定连接氮气进气口，氮气进气口上连接氮气瓶，氮气进气口上固定连...
- 牛楠赵巍李卉李君良杜先才王婵朱亚洲
- 文献传递
- 细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析被引量：7
- 2016年
- 目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-
- 赵殷奇李子华王浩朱明星牛楠王娅娜赵嘉庆李娜佟雪琪宋佳卉赵巍
- 关键词：细粒棘球绦虫原头节免疫原性
- 缺氧培养下NRF-1基因对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响被引量：4
- 2016年
- 目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照,同时设计并合成干扰慢病毒载体;将重组质粒与包装质粒一同转染293T细胞,收集病毒颗粒后感染H9c2细胞并通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株;在1%O2、5%CO2、94%N2条件下培养转染的细胞株48h,使用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体膜电位。结果获得NRF-1过表达细胞株、空载体细胞株及shRNA干扰细胞株;缺氧条件下三组细胞存活率均减弱,与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达组细胞活力较高,shRNA干扰组的细胞活力最弱;另外,流式细胞术检测线粒体膜电位发现缺氧培养后线粒体膜电位下降。与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达细胞株线粒体膜电位下降较轻,shRNA干扰细胞株线粒体膜电位下降最明显。结论说明大鼠心肌细胞通过NRF-1基因的过表达可以减缓由缺氧造成的线粒体膜电位的下降,提高细胞在缺氧条件下的存活能力。
- 牛楠宋佳卉赵殷奇王浩朱明星佟雪琪李娜赵巍宋熔
- 关键词：大鼠心肌细胞缺氧细胞活力线粒体膜电位
- 缺氧条件下核呼吸因子-1对大鼠心肌细胞线粒体功能的影响
- 目的： 为了研究NRF-1基因对大鼠心肌细胞（H9c2）线粒体功能代谢的影响，我们建立1％O2+5%CO2的物理缺氧模型，观察NRF-1基因能否改善大鼠心肌细胞在缺氧条件下的生长状态及能量代谢水平，旨在为心力衰竭的基因...
- 牛楠
- 关键词：心力衰竭基因治疗线粒体能量代谢
- 缺氧条件下NRF-1基因过表达的大鼠心肌细胞增殖和凋亡变化被引量：4
- 2018年
- 目的构建核呼吸因子-1(NRF-1)过表达的大鼠心肌细胞,观察缺氧条件下细胞增殖和细胞凋亡的变化。方法将大鼠心肌细胞H9C2分为NRF-1过表达组、空载体组和正常对照组,NRF-1过表达组和空载体组分别用NRF-1过表达慢病毒及空载体病毒进行转染,正常对照组不做处理。将三组细胞置于缺氧用三气培养箱中进行缺氧培养(37℃、1%O_2+5%CO_2+94%N2)24 h。采用实时无标记分析(RTCA)技术观察缺氧6、12、24 h时的细胞增殖水平,流式细胞仪检测缺氧24 h时细胞凋亡率,qRT-PCR法检测缺氧24 h时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)mRNA的相对表达量。结果缺氧12、24 h时,NRF-1过表达组细胞增殖水平高于正常对照组和空载体组;缺氧24 h时,与空载体组和正常对照组比较,NRF-1过表达组细胞凋亡水平降低,且caspase-3 mRNA表达水平较低(P均<0.05)。结论 NRF-1过表达可以降低缺氧条件下心肌细胞的凋亡,从而提高心肌细胞在缺氧条件下的存活能力。
- 孙红丽杨继辉牛楠朱明星赵巍宋熔
- 关键词：缺氧心肌细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
- NRF-1基因敲除对NRK-52E细胞凋亡的影响
- 2019年
- 目的探讨NRF-1基因对NRK-52E细胞凋亡的影响。方法构建敲除NRF-1基因的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA,包装慢病毒,转染NRK-52E细胞,实验设control组、vector组和mutant组;通过嘌磷霉素筛选、T7E1酶切分析、Sanger测序及Western blot法筛选NRF-1基因稳定敲除的细胞系;用含H2O2的完全培养液(终浓度为500μmol·L-1)将control组、vector组和mutant组细胞培养4h建立NRK-52E细胞氧化应激损伤模型。Western blot法检测氧化应激条件下各组细胞中cyt-c、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果 T7E1酶切分析显示,sgRNA2为NRF-1基因的有效靶点;Sanger测序结果获得了3个基因缺失的突变体;Western blot结果显示,与control组及vector组比较,mutant组细胞中NRF-1蛋白表达水平降低(P<0.05或<0.01);NRF-1基因敲除后,与control组和vector组相比,氧化应激损伤时,mutant组细胞中的cyt-c、Cleaved-caspase3、Bax表达水平增高,Bcl-2表达水平降低(P<0.05或<0.01);Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡结果显示,与control组和vector组比较,氧化应激条件下mutant组细胞凋亡率增高[(11.45±0.64)%vs(3.45±0.14)%,(11.45±0.64)%vs(3.60±0.28)%)(P均<0.01)。结论 NRF-1基因敲除增强了氧化应激条件下NRK-52E细胞凋亡水平。
- 孙红丽牛楠董飞张婷瑞朱明星朱明星
- 关键词：急性肾损伤基因敲除细胞凋亡
- 缺氧对大鼠心肌细胞损伤的影响及机制被引量：6
- 2017年
- 目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态;透射电镜观察细胞内部结构;活性氧检测试剂盒检测胞内活性氧(ROS);Western印迹法检测线粒体色素C蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞坏死程度。结果缺氧状态下,随着缺氧时间的不断增加,大鼠心肌细胞株H9C2的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变,细胞器结构明显损伤,ROS水平升高,线粒体细胞色素释放增加,细胞凋亡率明显增加,LDH的释放率明显增高。结论缺氧会造成大鼠心肌细胞的生长速度减慢、形态改变及心肌线粒体损伤,最终导致细胞凋亡和细胞坏死。
- 宋佳卉牛楠朱明星佟雪琪赵殷奇徐士梅宋熔赵巍
- 关键词：缺氧线粒体损伤凋亡坏死
- LncRNA 017418及细胞因子在细粒棘球蚴rP29免疫小鼠中的表达分析
- 2020年
- 目的初步探讨长链非编码RNA 017418(lncRNA 017418)和细胞因子在细粒棘球蚴重组蛋白P29(rP29)诱导小鼠产生免疫反应中的表达。方法重组融合表达菌株pET28a-P29/BL21与LB液体培养基混合孵育,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化rP29。36只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、佐剂组和免疫组,每组12只,免疫组将纯化的10μg rP29与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,腹部皮下3点注射,总剂量100μl/鼠,佐剂组注射等体积弗氏完全佐剂,对照组不作处理;首次免疫后2周,相同剂量加强免疫1次,加强免疫采用弗氏不完全佐剂。加强免疫后2周,无菌环境下制备脾细胞悬液,分离淋巴细胞;流式细胞术分选淋巴细胞亚群CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA 017418、Notch1、白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-10在淋巴细胞中的表达量;采用SPSS 17.0统计学软件和GraphPad Prism6.0软件对实验结果进行分析。结果经IPTG诱导表达、亲和层析法纯化,rP29蛋白相对分子质量(Mr)约为31000。qRT-PCR检测lncRNA 017418在脾淋巴细胞中的相对表达量,免疫组为2.25±0.10,高于对照组(0.81±0.05)和佐剂组(0.99±0.13)(P<0.01)。流式细胞术分析的CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞所占比例分别为:对照组22.0%、9.2%和59.8%,佐剂组22.8%、7.6%和60.7%,免疫组22.1%、9.7%和60.4%。LncRNA 017418在免疫组CD4^+T淋巴细胞中的相对表达量为1.49±0.03,高于对照组(0.97±0.02)和佐剂组(1.06±0.10)(P<0.01),LncRNA 017418在免疫组CD8^+T细胞中的相对表达量为1.87±0.12,与对照组(2.06±0.14)和佐剂组(2.00±0.09)相比,差异无统计学意义(P>0.05),LncRNA 017418在免疫组B淋巴细胞中的相对表达量为1.03±0.03,与对照组(0.97±0.07)和佐剂组(1.08±0.12)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1在免疫组CD4+T淋巴细胞中的相对表达量为1.92±
- 王婵杨松昊董飞杜先才杨继辉牛楠朱明星朱明星王浩王娅娜
- 关键词：CD4^+T淋巴细胞长链非编码RNA免疫保护
- 包虫病诊断抗原分子Eg-00512的筛选、重组表达及抗原性鉴定被引量：5
- 2017年
- 目的筛选细粒棘球绦虫原头蚴抗原分子Eg-00512,并进行重组表达、纯化及免疫特性鉴定,以期作为棘球蚴病特异性诊断抗原。方法对国家人类基因组南方研究中心(CHGCS)发表的细粒棘球绦虫4个不同发育阶段的表达谱数据进行差异比较分析,筛选仅在原头蚴阶段特异表达的基因Eg-00512;利用DNAStar软件包对其编码蛋白Eg-00512进行抗原表位分析;选取合适的序列片段作为目的片段,构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经诱导表达、纯化获得重组蛋白rEg-00512。将BALB/c小鼠随机分为免疫组、佐剂对照组、PBS对照组,分别经皮下多点注射重组蛋白、PBS+弗氏佐剂和PBS,2周后加强免疫一次。分别于免疫前,第一次免疫后2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后5周摘眼球法采血,采用ELISA检测各时间点血清中特异性IgG抗体水平变化;以该血清为一抗,采用Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。结果筛选出仅在细粒棘球蚴原头蚴阶段高表达的Eg-00512基因。该基因编码203个氨基酸,分子质量单位为23ku,其抗原表位主要位于1-15、55-93、111-119、126-149、166-194和199-202氨基酸残基及其附近。成功构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经IPTG诱导表达重组蛋白rEg-00512。重组蛋白rEg-00512纯化后免疫小鼠诱导产生特异性IgG抗体,其中免疫5周时抗体达最高水平A450值为1.807±0.767,与佐剂对照组0.111±0.014和PBS对照组0.132±0.0246比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot显示,该重组抗原可被免疫鼠抗血清及细粒棘球蚴原头蚴感染鼠血清识别,而不与正常小鼠血清反应。结论成功筛选并获得重组蛋白rEg-00512,该蛋白具有较好的抗原性,可作为棘球蚴病免疫诊断候选抗原。
- 佟雪琪赵殷奇李子华朱明星王浩赵嘉庆宋佳卉牛楠徐士梅赵巍
- 关键词：细粒棘球绦虫免疫原性
