王纯才
- 作品数:3 被引量:2H指数:1
- 供职机构:南京医科大学附属无锡第二医院更多>>
- 发文基金:江苏省医学重点人才培养基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域:医药卫生更多>>
- 稳定表达miR-363-3p的重组慢病毒载体介导的前列腺癌细胞株DU145的构建及初步鉴定
- 2016年
- 目的构建含有miR-363-3p的慢病毒表达载体,获得能够稳定表达miR-363-3p的DU145细胞株并初步进行细胞形态学实验。方法利用PCR扩增miR-363-3p片段,插入慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-tRFP中构建重组慢病毒质粒p CDH-miR-363-3p。将慢病毒包装三质粒表达系统的重组慢病毒质粒p CDH-miR-363-3p,包装质粒ps PAX以及包膜质粒p MD2.G共转染人胚肾上皮细胞(HEK293T)细胞中,同时以慢病毒空载体p CDH-vector作为阴性对照。收集含有病毒颗粒细胞的病毒上清液,测定Lentivirus-miR-363-3p和Lentivirus-vector的病毒滴度。再用重组慢病毒Lentivirus-miR-363-3p及阴性对照Lentivirus-vector以相同感染复数(MOI)的病毒量分别感染DU145细胞,72 h后,在荧光显微镜下通过观察红色荧光蛋白(RFP)的表达情况观察被感染细胞数。采用反转录实时定量PCR(RT-q PCR)方法检测两组细胞系中miR-363-3p表达情况。将获得的两组细胞进行平板划痕实验,初步观察其细胞生长行为的差异。结果 PCR成功扩增出miR-363-3p片段,插入慢病毒载体p CDH-CMV-MCSEF1-tRFP后,利用限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒质粒p CDH-miR-363-3p构建成功。通过慢病毒包装三质粒表达系统获得表达miR-363-3p的重组慢病毒,测得滴度约为1.5×107efu/ml。以相同MOI的重组慢病毒Lentivirus-miR-363-3p以及Lentivirus-vector分别感染DU145细胞72 h后,在荧光显微镜下能够明显观察到红色荧光,且RT-q PCR检测结果显示,感染miR-363-3p DU145细胞中miR-363-3p表达水平显著高于感染miR-vector DU145细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。平板划痕实验结果显示划痕后24 h时两组细胞生长具有明显差异(P<0.01),但48 h时两组生长的细胞均已完全覆盖划痕。结论成功构建了含miR-363-3p的慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒能够有效地感染DU145细胞,为下一步实验奠定了坚实的基础。初步的细胞形态学实验-平板划痕显�
- 肖荣杨元强汪洋王纯才包文平葛东升冯宁翰
- 关键词:重组慢病毒载体DU145细胞
- miR-363-3p表达异常对人前列腺癌细胞生物学表型的影响被引量:2
- 2016年
- 目的研究微小RNA-363-3p(miR-363-3p)在人前列腺癌细胞和正常前列腺上皮中的表达并探究miR-363-3p对前列腺癌细胞生物学表型的影响。方法分别提取人前列腺癌细胞DU145、PC3和正常肝细胞RWPE-1的总RNA,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测miR-363-3p的表达。运用脂质体介导的方法分别将慢病毒空载体pCDH-vector(简称PCDH)及构建好的慢病毒质粒pCDH-miR-363-3p(简称miR-363-3p质粒)和pCDH-miR-363-3p sponge(miR-363-3p sponge质粒)转染DU145、PC3细胞,利用CCK8和平板克隆实验检测miR-363-3p表达改变后对细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测miR-363-3p表达变化对细胞体外迁移侵袭能力的影响;微管实验检测miR-363-3p表达变化对细胞体外成管能力的改变。结果 miR-363-3p在人前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞中的表达水平相比,显著上调(P<0.05)。体外实验中,过表达miR-363-3p能显著增强人前列腺癌细胞的增殖、迁移侵袭及微管形成能力,下调miR-363-3p后上述生物学表型均受到抑制,且差异显著。结论miR-363-3p在人前列腺癌细胞中表达上调,过表达miR-363-3p可促进人前列腺癌细胞体外增殖、迁移侵袭和微管形成能力。在前列腺癌发病进程中,miR-363-3p可能扮演促癌基因的角色,有望成为前列腺癌治疗的新靶点。
- 王纯才包文平汪洋邵宁徐新宇董坚鲁晓杰冯宁翰
- 关键词:微RNAS前列腺肿瘤细胞运动
- miR-363-3p表达异常对人前列腺癌细胞生物学表型的影响
- 前列腺癌(Prostate cancer,Pca)已经成为威胁男性健康最严重的问题之一,随着我国人口老龄化的加剧和治疗水平的提高,更多的前列腺癌患者能够更早被发现;而生活方式及饮食结构逐渐西化,又导致前列腺癌的发病率发生...
- 王纯才
- 关键词:前列腺癌细胞增殖