目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consis tregion of light chain,CK)。采用改进的重叠延伸PCR(SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-载体转化E.coliDH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。结果:①构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库;②经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。结论:采用改进的重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。
