葛欣
- 作品数：14 被引量：32H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金国家科技支撑计划更多>>
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- 甲基营养菌MP688胞外多糖合成的影响因素研究
- 2013年
- 目的：考察培养基组分和发酵条件对甲基营养菌MP688合成胞外多糖的影响，确定最主要的影响因素。方法：将甲基营养菌MP688接种到基础培养基中，通过改变基础培养基的氮源、培养温度、初始pH值和培养时摇床转速等条件，检测在每种条件下培养5 d后发酵液中的多糖含量，确定每种因素的最适范围；进而选取8个因素，通过Plackett-Burman实验设计12组实验，通过检测每种组合条件下的多糖产量和结果统计分析，确定影响多糖合成的最主要因素。结果：甲基营养菌合成胞外多糖的最适氮源为硝酸钠，最适温度为30-37°C，最适pH值为6.5-7.0，最适摇床转速为200-250 r/min；甲醇、硝酸钠、初始pH值和接种量是MP688合成多糖的主要影响因子。结论：运用Plack-ett-Burman实验设计筛选到甲基营养菌MP688胞外多糖合成的主要影响因子，MP688是具有多糖生产潜力的菌株。
- 葛欣韩月梅熊向华汪建华刘党生张惟材
- 关键词：甲基营养菌胞外多糖
- 一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用
- 本发明提供了一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的一个重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降...
- 葛欣张惟材熊向华
- 文献传递
- 一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法及所用的发酵培养基
- 本发明公开了一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法和所用发酵培养基。采用控氧发酵培养法培养甲基营养菌，发酵培养基中含有的碳源为甲醇、氮源为硫酸铵，在发酵过程中分阶段控制溶解氧水平为饱和溶氧的30-50%，通过补料控制pH在5...
- 葛欣张惟材熊向华汪建华
- 文献传递
- 通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株被引量：2
- 2014年
- 目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。
- 韩月梅葛欣王鹤熊向华汪建华刘党生张惟材
- 关键词：甲基营养菌吡咯喹啉醌电击转化突变
- 甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究被引量：6
- 2014年
- 目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。
- 李大攀葛欣魏静远熊向华汪建华杨秀萍张惟材
- 关键词：甲基营养菌甲醇脱氢酶基因敲除吡咯喹啉醌
- 甲基营养菌MP688中启动子探针载体的构建被引量：2
- 2012年
- 目的:以半乳糖苷酶基因作为报告基因,构建适于探测甲基营养菌MP688启动子的载体。方法:通过PCR扩增半乳糖苷酶基因片段,连入质粒pCM66构建启动子活性探针载体pMPlacZ。根据MP688的基因组序列设计引物,通过PCR扩增5个pqqA基因、核糖体亚基A基因(rpsA)、核糖体亚基B基因(rpsB)、伴侣分子groel基因和甲醇脱氢酶基因(mdh)等共9个基因的启动子序列,将这9个启动子片段连入pMPlacZ进行活性测定。结果:构建了一个适于探测甲基营养菌MP688的启动子活性的载体pMPlacZ;利用构建的报告系统对MP688中9个基因的启动子进行了活性比较,得到3个与吡咯喹啉醌合成相关的强启动子。结论:构建的启动子活性检测载体可以有效、灵敏地用于MP688强启动子的筛选和启动子活性检测。
- 杜宝华葛欣王文溪熊向华汪建华何建勇张惟材
- 关键词：甲基营养菌半乳糖苷酶
- 甲基营养菌MP688葡萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究被引量：4
- 2013年
- 目的:鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法:对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计引物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载体pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果:分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ_2164的氨基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ_2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论:MPQ_2164是一个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源表达。
- 王文溪葛欣韩月梅熊向华汪建华张景海张惟材
- 关键词：甲基营养菌表达纯化吡咯喹啉醌
- 酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测
- 2013年
- 目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果:扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×103;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论:在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。
- 赵楠熊向华葛欣汪建华夏焕章张惟材
- 关键词：原核表达生物活性活性电泳
- 山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶及其应用
- 本发明提供氧化葡糖杆菌CGMCC No.1.637的山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.2和4所示。本发明还提供编码上述蛋白的基因或基因簇。本发明将带自身调控序列的SNDH-SDH基因簇连入...
- 张惟材熊向华汪建华葛欣陈微微侯伟
- 文献传递
- 高效液相色谱法分析吡咯喹啉醌被引量：3
- 2015年
- 目的：建立一种通过高效液相色谱（HPLC）定量测定吡咯喹啉醌（PQQ）的分析方法。方法：将PQQ标准品及发酵制备的PQQ结晶粉末溶于10 mmol/L NaOH溶液，利用高效液相色谱仪进行测定。采用Waters XBridge C18（4.6 mmx150 mm，5μm）作为分离柱，用甲醇-水（用三氟乙酸调节pH值为1.0）梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，于室温下检测PQQ，检测波长为365.8 nm。结果：检测得PQQ标准品的保留时间约为7.8 min，在0.03125-1 mg/mL范围内线性关系良好，相关系数（r2）在0.9999以上，平均回收率为98.6%。结论：高效液相色谱法分析PQQ的灵敏度和准确度高，是一种可靠的PQQ定量分析方法。
- 魏静远李大攀赵炜楠葛欣毕波熊向华汪建华杨秀萍张惟材
- 关键词：高效液相色谱吡咯喹啉醌分析方法
