王刚
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 供职机构：山西医科大学第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山西省自然科学基金山西省青年科技研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 嗜血细胞综合征合并血栓性血小板减少性紫癜一例并文献复习
- 2017年
- 目的 提高对嗜血细胞综合征（HPS）合并血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的诊治认识.方法 回顾性分析1例HPS表现有TTP患者的临床资料,并进行相关文献复习.结果 患者诊断为HPS合并TTP,从发病至死亡不足1个月,关于此类病例的报道少见.结论 HPS患者本身可出现血小板计数显著减少,当同时表现有TTP时,极易误诊或延误诊断.
- 陈玙董春霞王梅芳韩孟汝郭建利王刚杨林花
- 重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义被引量：2
- 2013年
- 本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。
- 王刚姜博文杨林花聂欣贾辰亮刘静申泉柴宝峰
- 关键词：血友病B无义突变
- 凝血因子Ⅸ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及其在HEK-293细胞的表达
- 2016年
- 目的以含有凝血因子Ⅸ（FⅨ）cDNA的pcDNA／FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1／FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达。方法以pcDNA／FⅨ质粒为模板，扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框（ORF）区，使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接，连接产物进行转化后筛选阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1／FⅨ转染HEK-293细胞后，分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性。结果成功构建pIRES2-ZsGreen1／FⅨ并转染HEK-293细胞，实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨmRNA，激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成，野生型质粒pIRES2-ZsGreen1／FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为（92．03±0．29）％、（86．89±8．78）％，无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0。结论成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体。
- 陈剑芳张耀方康建民秦秀玉王梅芳王刚杨林花
- 关键词：血友病B真核细胞质粒
- 凝血因子Ⅷ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及鉴定
- 2016年
- 目的本研究以含有凝血因子Ⅷ(FⅧ)cDNA的pCI/FⅧ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并进行鉴定,在HEK-293细胞中表达。方法以pCI/FⅧ质粒为模板,扩增出FⅧ的开放阅读框(ORF)区,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅧ转染HEK-293细胞后,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测野生型FⅧ基因mRNA表达水平。结果成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并转染入HEK-293细胞中,实时定量PCR检测FⅧmRNA在HEK-293细胞中的表达,激光共聚焦显微镜观察转染情况。结论为实时观察FⅧ真核表达载体在HEK-293细胞中的表达及FⅧ基因突变导致血友病A的分子发病机制的研究奠定实验基础。
- 陈剑芳杨林花张耀方王梅芳康建民秦秀玉王刚
- 关键词：血友病A真核表达载体分子发病机制
- microRNA125对无义突变的人凝血因子Ⅸ基因调控的分子机制被引量：1
- 2016年
- 目的构建人凝血因子Ⅸ小基因（Mini．hF9）及无义突变体，检测其mRNA表达水平，分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini—hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等，同时转染miR－125模拟物，通过实时荧光定量PCR（q—PCR）检测Mini—hF9基因mRNA表达水平。结果成功构建了Mini—hF9并在细胞中正确剪接。成功构建了无义突变体M1（nt34G〉TinExon7）、M2（nt52G〉TinExon7）和M3（nt85G〉TinExon7）。M1和M2突变体中Mini．hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14．1％（t=-15．464，P=0．004）和22．4％（t=-15．755，P=0．004），通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解（nonsense—mediatedmRNAdecay,NMD）所致。分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后，M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1．70倍（t=-4．883，P=-0．039）和2．40倍（t=-17．537，P=0．003），M2突变体Mini—hF9mRNA水平分别升高到2．02倍（t=-19．264，P=0．003）和2．07倍（t=-9．158，P=0．012）。结论无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素；microRNA125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平。
- 王刚杨林花柴宝峰张翠明王梅芳王琨陈玙李玲
- 关键词：因子IX微RNAS基因表达调控
