目的构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒。方法PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-ac-tivated prote in k inaseα2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBT-AMPKα2。经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达。并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 B lue MRF’菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-am ino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用。结果酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确。诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcI/AMPKα2融合蛋白。转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用。结论构建的pBT-AMPKα2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选。
目的利用大肠杆菌双杂交系统筛选脑组织中与大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinaseα2,AMPKα2)相互作用的蛋白质,以期进一步探讨AMPKα2在脑内的生物学功能及调节机制。方法以重组质粒pBT-AMPKα2作为诱饵,应用大肠杆菌双杂交系统筛选大鼠胎脑cDNA文库,并对结果进行生物信息学分析。结果筛选出与AMPKα2结合的蛋白7个,包括聚合泛素、热休克蛋白8(heat shock protein8,HSP8)、磷酸果糖激酶、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COXⅠ)、人类白细胞抗原B关联性转录物3(HLA-B-associatedtranscript3,BAT3)异构体1、蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(protein tyrosine phosphatase receptor type D,Ptprd)、岛-脑蛋白1(islet-brain1,IB1)。结论寻找到了脑内与AMPKα2相互作用的7种蛋白:聚合泛素、HSP8、磷酸果糖激酶、COXⅠ、BAT3异构体1、Ptprd、IB1。
目的:AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在脑内作为多功能能量感受器发挥作用,主要协调代谢和能量的需要。脑神经元中AMPKα2亚基的含量明显高于α1亚基,本研究选择α2亚基作为对象,研究其在大肠杆菌中的表达情况,为以蛋白原核表达为前提的研究技术的应用提供实验依据。方法:大鼠AMPKα2蛋白编码区片段通过PCR方法从重组pcDNA3质粒中扩增后,克隆至带有λcI基因的pBT载体,构建融合表达载体pBT-AMPKα2。通过核苷酸序列测定证实结果正确后,转化pBT-AMPKα2入大肠杆菌XL-1 Blue MR菌株,IPTG诱导目的蛋白表达。结果:Western blotting显示AMPKα2-λcI融合蛋白表达,分子量约为89ku,与预期相符合。结果还表明AMPKα2-λcI融合蛋白以可溶性蛋白和不溶性包涵体两种形式存在,前者不稳定易发生降解,生成AMPKα2和λcI蛋白,分子量分别是62ku和27ku;后者稳定不发生降解。结论:AMPKα2亚基能以AMPKα2-λcI融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达,这为今后以pBT-AMPKα2融合表达载体为工具利用大肠杆菌双杂交系统筛选AMPKα2的相互作用蛋白奠定基础。
