万利
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：广州医科大学更多>>
- 发文基金：广东省医学科学技术研究基金广东省中医药管理局基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Nanog慢病毒载体构建及在胚胎干细胞分化调控中的应用
- 2016年
- 背景:在胚胎干细胞分化调控研究中,仍缺少安全有效的组织特异性启动子介导的荧光报告基因的慢病毒表达载体。目的:构建一个表达多能干细胞组织特异性启动子Nanog同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒表达载体Puro-Nanog-hr GFP,建立小鼠胚胎干细胞转基因细胞系,并观察其在小鼠胚胎干细胞细胞诱导分化过程中的表达。方法:利用PCR扩增Nanog基因,通过LR反应连接荧光报告基因hr GFP构建慢病毒表达载体Puro-Nanog-hr GFP。慢病毒包装并转导小鼠胚胎干细胞后运用嘌呤霉素筛选得到小鼠胚胎干细胞转基因细胞系并进行鉴定,然后诱导其分化,观察随着小鼠胚胎干细胞的分化Nanog的表达情况。结果与结论:通过特定引物PCR鉴定证实,慢病毒表达载体Nanog-hr GFP构建成功,将其成功导入小鼠胚胎干细胞,经筛纯化得到表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞单克隆细胞系,并通过诱导其分化可观察到绿色荧光表达逐渐减弱,可为进一步调控干细胞分化奠定基础。
- 陈霏万利李艳李欣
- 关键词：干细胞胚胎干细胞慢病毒GATEWAY技术NANOG
- TIPE2基因过表达慢病毒载体的构建及转染人脐静脉血管内皮细胞被引量：2
- 2017年
- 目的构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2（TIPE2）基因过表达慢病毒载体，包装慢病毒并体外感染人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）。方法设计TIPE2基因扩增引物，PCR扩增获得人源TIPE2目的基因片段并进行纯化，构建重组质粒GV287-TIPE2经琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行测序鉴定。重组质粒GV287-TIPE2转染293T细胞构建GV287-TIPE2慢病毒载体，收获并浓缩病毒颗粒，实时定量PCR法检测病毒滴度。GV287-TIPE2过表达慢病毒体外转染HUVEC，荧光显微镜下鉴定转染效率，免疫印迹法检测转染细胞的TIPE2蛋白表达。结果PCR及测序鉴定证实重组质粒GV287-TIPE2中TIPE2基因目的片断插入位置和序列正确。包装的GV287-TIPE2慢病毒载体其病毒滴度为2．0×10^8TU／ml。GV287-TIPE2过表达慢病毒转染293T细胞后在荧光显微镜下可见绿色强荧光；收获病毒转染HUVEC后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，且荧光强度不随培养时间延长而衰退。免疫印迹显示，GV287-TIPE2过表达慢病毒转染HUVEC后其TIPE2蛋白表达明显升高（P〈0．001）。结论成功构建GV287-TIPE2慢病毒载体，包装得到高浓度病毒液，转染HUVEC能稳定过表达TIPE2蛋白。
- 熊石龙万利龚芳范灿波毛欣茹
- 关键词：慢病毒人脐静脉血管内皮细胞
