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口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位被引量：4: 2017年; 为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。; 殷冬冬杨侃侃白彩霞赵玉洁潘飞徐燕华梅跃辉苏莉钟灵毓崔佣楸张子军祁克宗王桂军王勇; 关键词：VEGF基因原核表达亚细胞定位

口疮病毒020基因的克隆、表达及多抗制备被引量：6: 2017年; 羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。; 王勇赵玉洁杨侃侃殷冬冬白彩霞潘飞梅跃辉颜秀梅王君徐前明蒋书东; 关键词：羊口疮病毒克隆原核表达多克隆抗体

表达羊口疮病毒B2L基因“自杀性”DNA疫苗的构建及鉴定: 根据羊口疮病毒AH-GY13株B2L基因序列,设计特异性引物,两端分别添加BamHⅠ和XmaⅠ酶切位点。提取该毒株的DNA并以其为模板,扩增出B2L基因,再将该基因克隆至'自杀性'DNA疫苗载体pSCA 1中,构建重组真...; 白彩霞殷冬冬潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因; 文献传递

羊口疮病毒安徽株的分离鉴定及其B2L和F1L基因的序列分析: 为确定安徽肥东某山羊场发生的疑似羊口疮(orf)的病原,利用MDBK细胞从送检的病羊唇部痂皮中分离获得病毒,通过PCR鉴定确定病原为羊口疮病毒(ORFV),并将其命名为ORFV/AH-FD/2016/China株。然后对...; 殷冬冬白彩霞潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因; 文献传递

羊口疮病毒F1L基因的原核表达与鉴定: 本研究设计一对特异性引物扩增羊口疮病毒F1L基因序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-6P-1-F1L,将重组质粒转化到Rosetta感受态细胞中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAG...; 白彩霞殷冬冬潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇; 关键词：羊口疮病毒原核表达; 文献传递

表达羊口疮病毒B2L基因重组腺病毒的构建及鉴定被引量：4: 2017年; 为构建表达羊口疮病毒(ORFV)B2L基因的重组腺病毒,提取实验室保存的ORFV AH-F10临床分离株的病毒核酸,PCR扩增B2L基因,将其克隆至穿梭载体中,再将重组穿梭质粒pHBAd-ORFV-B2L与骨架载体质粒pHBAdBHGloxΔE1利用脂质体共转染HEK293细胞,转染后48h收获包装成功的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L,对rAdORFV-B2L进行病毒滴度测定及遗传稳定性鉴定。结果表明:构建获得的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L病毒滴度达到107.9 TCID50·μL^(-1)。Western-blot检测结果表明rAd-ORFV-B2L在体外能够表达B2L蛋白,且能够与ORFV多抗血清发生特异性反应。RT-PCR检测结果表明,连续传代的rAd-ORFV-B2L能够稳定表达外源蛋白B2L。该研究为后续腺病毒疫苗的动物保护试验奠定基础。; 王勇杨侃侃王元红俞赵荣潘飞崔佣楸苏莉钟灵毓徐前明蒋书东李永东; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因重组腺病毒

表达口疮病毒B2L基因自杀性DNA疫苗的构建及鉴定被引量：1: 2016年; 根据口疮病毒AH-GY13株B2L基因序列设计特异性引物,两端分别添加Bam HⅠ和XmaⅠ酶切位点。提取该毒株的DNA并以其为模板,扩增出B2L基因,再将该基因克隆至自杀性DNA疫苗载体pSCA1中,构建重组真核表达质粒pSCA-B2L。将该重组质粒转染BHK-21细胞,并通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot验证B2L在体外的表达情况。IFA和Western-blot结果表明,B2L蛋白在体外能够正常表达,且具有良好的反应原性。试验中成功构建的真核表达质粒pSCA-B2L,为进一步研制口疮病毒自杀性DNA疫苗奠定了基础。; 白彩霞殷冬冬潘飞赵玉洁岳晓琳张子军祁克宗王桂军王勇; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因自杀性DNA疫苗

羊口疮病毒的分离鉴定及其遗传进化分析被引量：9: 2017年; 为确定安徽肥东某山羊场发生的疑似羊口疮(ORF)的病原,利用MDBK细胞从送检的病羊唇部痂皮中分离获得病毒,通过PCR鉴定确定病原为羊口疮病毒(ORFV),并将其命名为ORFV/AH-FD/2016/China株。然后对分离株的B2L基因和F1L基因进行克隆、测序,并与其他ORFV序列进行遗传进化分析。结果表明:ORFV/AH-FD/2016/China株的B2L基因长1 137bp,编码279个氨基酸,F1L基因长1 023bp,编码341个氨基酸。与GenBank中收录的其他ORFV流行株相比,B2L基因的核苷酸同源性为96.9%~99.5%,推导的氨基酸同源性为95.5%~98.9%;F1L基因的核苷酸同源性为95.3%~98.3%,推导的氨基酸同源性为94.9%~99.1%。利用软件构建系统进化树,根据B2L基因遗传进化分析结果表明,该分离株与甘肃分离株的亲缘关系最近;根据F1L基因遗传进化分析结果表明,该分离株与福建分离株亲缘关系最近。基于B2L基因和F1L基因的遗传进化分析,其分离得到的病毒株与国内不同地区分离毒株的遗传差异不大。该研究为ORFV的后续研究提供了临床试验材料和流行病学依据。; 王勇殷冬冬杨侃侃白彩霞潘飞梅跃辉赵玉洁徐前明李永东; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因遗传进化分析

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位被引量：3: 2017年; 对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。; 王勇潘飞杨侃侃王元红俞赵荣梅跃辉崔佣楸苏莉徐前明李永东; 关键词：传染性脓疱病毒原核表达亚细胞定位

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潘飞