任小侠
- 作品数:31 被引量:27H指数:3
- 供职机构:中国兽医药品监察所更多>>
- 发文基金:国家自然科学基金北京市科技计划项目国家科技重大专项更多>>
- 相关领域:农业科学生物学自动化与计算机技术医药卫生更多>>
- 禽结核菌素生产用菌种的制备与鉴定
- 2023年
- 为制备禽结核菌素国家标准品,研究禽结核菌素生产用菌株禽分枝杆菌的菌种特性,对1992年冻干保存的3株菌CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203进行复苏,采用SPF鸡复壮,分离培养后冻干了新批次菌种,对菌种形态、生化特性、培养特性、毒力和抗原性进行了鉴定。结果表明,制备的菌种纯粹,形态、生化和培养特性符合禽分枝杆菌的生物学特征,免疫原性符合的兽用生物制品质量标准的规定。本研究为禽分枝杆菌的鉴定提供参考,也为制造禽结核菌素的工艺改进奠定基础。
- 王楠辛凌翔徐磊程君生王团结任小侠毛开荣李俊平
- 一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用
- 本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株,所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM...
- 王楠徐磊孙浩杰毛开荣辛凌翔丁家波蒋卉任小侠
- 文献传递
- 布鲁氏菌生物恐怖战剂RTqPCR现场检测方法研究
- 2022年
- 建立实时荧光定量PCR现场快速检测方法,对生物恐怖战剂布鲁氏菌进行检测。根据NCBI获得16S核糖体RNA基因序列,应用生物信息学确定检测特异性序列,设计扩增引物。通过引物量、退火温度、退火时间,建立3水平3因素正交试验确定试验最佳反应条件,并分析反应的敏感性,利用溶解曲线分析反应的特异性,并采集室外环境积水和土壤样本进行实际测试。结果表明:反应最优条件为Sybr Green qPCR mix 10μL,上下游引物各0.8μL,超纯水7.4μL,引物1μL,检测反应的灵敏度为220 CFU·mL^(-1),溶解曲线峰值单一,特异性良好。为现场布鲁氏菌基因检测提供一种有效、可靠的快速检测手段。
- 张立安宗鹏任小侠侯亚欣王楠王慧飞
- 关键词:布鲁氏菌生物恐怖实时荧光定量PCR
- 一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定被引量:2
- 2020年
- 本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示,试验成功获得了诱导突变株,其缺失片段大小为15070 bp;热凝集试验阳性,能被结晶紫染色,吖啶黄凝集试验阳性;对提取脂多糖进行银染,结果显示O链缺失,诱导株RB71脂多糖不完整;连续传代30次,PCR检测未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19;入侵RAW264.7细胞72 h时,其胞内存活率与亲本株相比极显著下降(P<0.01)。综上所述,本试验开发出一种能高效诱导光滑型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法,成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株,该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱,这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。
- 孙浩杰任小侠秦玉明朱良全蒋卉孙石静丁家波辛凌翔王楠李晓宁李巧玲毛开荣蔡亚南徐磊
- 关键词:粗糙型布鲁氏菌疫苗
- 牛巴氏杆菌病多重PCR检测技术的建立与应用被引量:3
- 2022年
- 【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌的多重PCR方法,为临床诊断牛巴氏杆菌病和病原分型提供技术支撑。【方法】参考多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC基因、bcbD基因和ecbJ基因特异区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定适宜退火温度(Tm);采用棋盘试验优化引物浓度并初步建立多重PCR方法;采用重组质粒标准品及阳性菌株菌液确定其敏感性(最小检测量);以8种常见牛感染病原体[溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)C1655、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C237、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)C1597、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)C3053、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)C79351、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)C1625、牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus)CAV1546和牛支原体分离株(Mycoplasma bovis)C65-1]核酸样本确定其特异性;制备3批诊断试剂,对敏感性和特异性样品进行批间和批内试验,确定其重复性;运用建立的方法使用3种不同型号的PCR仪检测敏感性和特异性样品,确定其适用性;通过检测临床样本及人工模拟感染样本评价临床应用效果。【结果】在Tm为55°C时,3对引物浓度分别为0.25、0.30和0.20μmol/L条件下建立多重PCR方法较优,可以同时检测多杀性巴氏杆菌血清A型(821 bp)、血清B型(203 bp)和血清E型(363 bp);该方法敏感性高,对重组质粒标准品pMD-A、pMD-B和pMD-E检测限分别为43.080、3.710和4.350 copies/μL,对阳性菌液最低检出限均为102 CFU细菌;其特异性强,仅对血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌有特异性扩增条带,同时对其他病原体均无扩增条带;该方�
- 王豪杰辛凌翔任小侠刘燕姚文生侯雪霞李旭妮朱良全
- 关键词:牛巴氏杆菌病多杀性巴氏杆菌血清型多重PCR
- 一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用
- 本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株,所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM...
- 王楠徐磊孙浩杰毛开荣辛凌翔丁家波蒋卉任小侠
- 分光光度法与活菌计数法测定副鸡禽杆菌菌液浓度的相关性研究
- 2024年
- 为建立一种快速测定副鸡禽杆菌菌液浓度的方法,本研究选取副鸡禽杆菌血清A、B和C型代表性菌株(CVCC254株、CVCC257株和CVCC256株),培养制备菌液,分别在450、540、600、650 nm波长测定其吸光度值(OD值),同时测定活菌计数值。回归分析两组数据,获取回归方程及标准曲线,分析回归方程的测定系数(R^(2))和标准曲线的点线离散度,确定最适测定波长。再选取不同培养时间点(10、12、14、16、18、20 h)的菌液,在最适波长下测定其OD值并代入回归方程获取活菌数,同时采用活菌计数法获取活菌计数值,将两组数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析,进一步验证分光光度法与活菌计数法测定菌液浓度的相关性。结果显示,3株菌液在600 nm波长测定的OD值与活菌计数值之间均呈最佳的线性关系,确定其菌液浓度最适测定波长均为600 nm,其回归方程分别为y=14.302x-0.1441(R^(2)=0.9962)、y=14.464x-0.2746(R^(2)=0.995)和y=14.681x-0.01326(R^(2)=0.9989),y为活菌计数值(×10^(8)CFU/mL),x为OD600值。3株培养至衰退期前的菌液在600 nm波长测定的OD值代入回归方程计算获得的活菌数值与其活菌计数值无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,衰退期前副鸡禽杆菌菌液的分光光度法与活菌计数法具有良好的相关性。因此,该分光光度法可用于快速测定衰退期前副鸡禽杆菌菌液浓度。
- 佟仁冬冯妍张一帜任小侠刘燕朱良全郝力力姚文生
- 关键词:副鸡禽杆菌分光光度法
- 羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验小鼠免疫攻毒法研究
- 2024年
- 为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护临界剂量,并在确认小鼠品系后开展平行关系研究,从而筛选出在小鼠模型上能够体现疫苗差异的最佳攻毒剂量。结果显示:合格疫苗1/2稀释度为最小免疫剂量,1/4稀释度为不符合规定的临界剂量;KM小鼠为替代方法最合适的小鼠品系;最佳攻毒剂量为使用2 MLD混合菌液,对免疫组和对照组进行攻毒,对照小鼠全部死亡,免疫小鼠至少保护70%。本研究建立了羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验实验动物免疫攻毒替代方法,这将有助于提升该类疫苗效力检验的稳定性和可靠性,为羊败血性链球菌病防控提供有力支撑。
- 张一帜任小侠冯妍李建辛凌翔孙淼王豪杰佟仁冬朱良全刘燕
- 关键词:马链球菌兽疫亚种
- 产气荚膜梭菌α-β2-ε融合蛋白原核表达及其间接ELISA方法的建立
- 2024年
- 【背景】产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起牛魏氏梭菌病(猝死症)的主要病原,严重危害养牛业。酶联免疫吸附法(ELISA)是诊断疫病及抗体检测的重要手段。【目的】表达重组α-β2-ε融合蛋白,并以此为靶抗原建立间接ELISA抗体检测方法,为临床检测牦牛C.perfringens及流行病学调查提供技术支持。【方法】利用生物信息学软件(EditSeq、Protean)和Jameson-Wolf方法分析牛源C.perfringens的α、β2和ε蛋白抗原指数,截取抗原指数较高肽段并用柔性Linker连接,经密码子优化后克隆至载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32α-β2-ε,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经培养、诱导表达、纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。以重组α-β2-ε融合蛋白作为包被抗原,经棋盘法和控制单一变量法优化反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定临界值并对其敏感性、特异性、重复性和临床效果进行评价。【结果】α的241‒403肽段、β2的161‒355肽段、ε的154‒331肽段抗原指数较高,将它们连接并融合表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白表达正确。ELISA抗体检测方法最佳工作条件为:抗原包被浓度5μg/mL 4℃过夜或37℃孵育60 min;5%脱脂乳于37°C封闭1 h;血清稀释度为1:150于37°C孵育30 min;酶标二抗1:2000于37°C孵育30 min;避光显色10 min。检测临界值为0.4702;敏感性高,可检测阳性血清最大稀释度为1:3200;特异性强,与溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于10%。四川省甘孜藏族自治州部分地区共277份牦牛血清样品检测结果显示,C.perfringens抗体阳性率为89.89%,与商品化产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒检测结果基本一致。【结论】成功制备重组α-β2
- 潘瑶任小侠胡云皓王雅茜刘燕蓝岚王豪杰岳怀宁吴建平朱良全
- 关键词:产气荚膜梭菌Α毒素间接ELISA
- 一种重组猪丹毒杆菌表面抗原SpaA蛋白及其应用
- 本发明公开了一种重组猪丹毒杆菌表面抗原SpaA蛋白及其应用,该重组猪丹毒杆菌表面抗原SpaA蛋白的编码基因采用具有高度保守性的野生型序列,具备良好的安全性、免疫原性、跨血清型保护效果,可产生具有足够免疫保护力抗体,对于猪...
- 张一帜张媛李建李俊平冯妍王秀丽刘元杰李旭妮王甲任小侠