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曾献武
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- 所属机构:成都生物制品研究所有限责任公司
- 所在地区:四川省 成都市
- 研究方向:医药卫生
- 发文基金:国家高技术研究发展计划
相关作者
- 杨会强
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- 作品数:28被引量:34H指数:3
- 供职机构:成都生物制品研究所有限责任公司
- 研究主题:乙型脑炎病毒 登革病毒 E蛋白 神经毒力 嵌合病毒
- 刘莉娜
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- 作品数:14被引量:15H指数:2
- 供职机构:成都生物制品研究所有限责任公司
- 研究主题:E蛋白 乙型脑炎病毒 登革病毒 神经毒力 嵌合病毒
- 刘杰
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- 作品数:34被引量:76H指数:4
- 供职机构:四川大学计算机学院
- 研究主题:乙型脑炎病毒 狂犬病疫苗 神经毒力 VERO细胞 乙型脑炎减毒活疫苗
- 孙艳
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- 作品数:17被引量:29H指数:3
- 供职机构:成都生物制品研究所有限责任公司
- 研究主题:狂犬病疫苗 VERO细胞 乙型脑炎减毒活疫苗 PM 病毒滴度
- 刘俐
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- 作品数:9被引量:6H指数:2
- 供职机构:成都生物制品研究所有限责任公司
- 研究主题:E蛋白 登革病毒 乙型脑炎病毒 嵌合病毒 多克隆抗体
- 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用,以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri-JYF的毒性小,免疫保护作用好...
- 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武
- 登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备被引量:2
- 2013年
- 目的原核表达并纯化登革病毒3型(DENV-3)E蛋白,并用于制备其抗体。方法采用PCR技术克隆DENV-3E蛋白基因,插入原核表达质粒载体pET-32a(+),转化大肠杆菌RoseRa(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经纯化后,免疫家兔,制备DENV-3E蛋白抗血清,并用于Westernblot鉴定。同时,采用ELISA测定其抗体效价,并初步应用于DENV-3的检测。结果重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103,主要以包涵体形式表达;用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后,获得的特异性抗血清效价为1:20480,该血清可与DENV-3发生特异性反应。结论本研究原核表达并纯化了DENV-3E蛋白,制备了高滴度的特异性兔抗血清。制备获得的DENV-3E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定,为登革病毒相关研究奠定了基础。
- 林华杨会强李竹石杨健赵宇刘俐葛永红曾献武曹毅乔代蓉李玉华
- 关键词:登革病毒E蛋白原核表达多克隆抗体
- 乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定
- 2019年
- 目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。
- 孙艳汪伟刘莉娜范凤鸣杨会强刘杰曾献武
- 关键词:神经毒力
- 乙型脑炎减毒活疫苗病毒群体的异质性分析被引量:2
- 2015年
- 目的通过观察疫苗病毒群体中病毒个体的遗传和生物学特征,分析SA14-14—2株乙型脑炎减毒活疫苗病毒的均一性,为疫苗病毒的遗传稳定性提供实验证据。方法对3批疫苗病毒连续进行3次蚀斑纯化后,各挑选8个蚀斑纯化株,扩大培养一代。比较24个病毒纯化株的包膜(envelope,E)蛋白基因序列、单斑培养病毒滴度以及蚀斑特征。结果24个纯化株中共有6个病毒株(25%)的E蛋白核苷酸发生变化,其中2株(8.3%)的核苷酸变异导致其编码氨基酸发生改变,这些变异占总核苷酸变异数的28.6%。动物实验表明,这2个纯化株没有引起小鼠神经毒力变化。在所有24个纯化株中,我国2010年版药典规定的影响疫苗病毒遗传稳定性的8个E蛋白关键位点的氨基酸均未发生改变。24个纯化株病毒的蚀斑大小和形态以及单斑培养滴度均无明显差异。结论疫苗病毒具有典型的准种群体多样性特征,但在群体病毒中未检测到E蛋白氨基酸位点为野生型病毒位点的个体病毒,因此,疫苗病毒具有很好的减毒群体特征和遗传稳定性。
- 杨会强汪伟刘莉娜何婷曾献武
- 关键词:脑炎病毒遗传异质性
- 乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响被引量:6
- 2013年
- 目的:探索乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸(E279)MK回复突变(M279K)对其毒力的影响。方法:用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含有SA14-14-2包膜蛋白M279K突变的全长cDNA质粒pACNR-JEV(M279K),并以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染导入BHK21细胞得到恢复病毒rJEV(M279K),并比较恢复病毒和疫苗病毒在蚀斑大小以及对小鼠神经毒力等方面的差别。结果:酶切及测序表明质粒模板成功构建,除人为引入的突变外(碱基1813处T→A),无任何碱基突变,并发现rJEV(M279K)形成比疫苗株更小的蚀斑,但毒力与疫苗株无显著差异。结论:E279回复突变影响乙脑疫苗SA14-14-2病毒蚀斑大小,但并未明显增强疫苗株对小鼠的神经毒力。
- 杨健李玉华李竹石林华汪伟刘丽娜倪谦枝曾献武杨会强
- 关键词:乙型脑炎病毒疫苗回复突变
- CA16滴度微量检测方法的建立及其验证被引量:1
- 2014年
- 目的建立用Vero细胞检测柯萨奇病毒A组16型(CAl6)滴度的方法,并对其适用性进行初步验证。方法通过对细胞种类的选择、细胞接种浓度和细胞病变判定时间的优化,建立测定CAl6滴度的半数细胞感染剂量法(CCID50法),并对其进行初步验证。结果通过对病毒感染后细胞病变情况的观察,确定了以Vero细胞作为CAl6病毒滴度检定用细胞。Vero细胞的最佳接种浓度和结果判定时间分别为5×10^4-1×10^5细胞/mL(即96孔板内每孔加入的最终细胞量为5×10^3-1×10^4细胞)和7d。由4组人员对6批CAl6病毒液进行重复检测,实验结果表明不同实验人员测定结果的变异系数(CV)在1.739%-4.974%之间,说明该方法测定结果重复性好,准确度高。结论该法简便、稳定,可以灵敏、准确地检测CA16病毒的滴度,可用于相关疫苗生产过程中的质量控制。
- 曾献武陈平李玫颖孙艳范凤鸣何敏刘杰
- 关键词:柯萨奇病毒A组16型病毒滴度
- 结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达
- 2004年
- 目的 为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法 PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果 从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论 本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。
- 吴悦涵鲍朗赵明才龙洋曾献武张会东
- 关键词:结核分枝杆菌原核表达质粒基因表达重组质粒
- 登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备被引量:1
- 2013年
- 目的构建登革病毒1型(DENV-1)E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta(DE3)感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。
- 汪伟丁显平杨会强李竹石谭帅赵宇刘莉娜谭昌耀曾献武
- 关键词:登革病毒原核细胞
- 治疗用卡介苗在膀胱癌预防及治疗中的作用被引量:2
- 2019年
- 目的探讨治疗用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine for treatment,BCGt)在膀胱癌预防及治疗中的作用。方法MB49细胞灌注小鼠膀胱,建立小鼠原位膀胱癌模型,进行BCGt预防性和治疗性试验,观察小鼠生存情况。末次治疗后第6天,经小鼠眼球采血,检测血清中IgG、IFNγ和IL-6的含量,同时取小鼠脾脏,检测特异性T淋巴细胞;每次治疗后检测小鼠尿液中一氧化氮(NO)含量;末次治疗45 d后进行记忆性免疫试验。结果成功建立了基于MB49细胞的小鼠原位肿瘤模型,致癌率100%。BCGt免疫预防和治疗两种方式均可延长小鼠的生存期;BCGt治疗后小鼠血清中的IgG、IFNγ、IL-6及尿液中NO含量明显升高(P<0.05),特异性T淋巴细胞反应明显增强(P<0.001),且可产生免疫记忆。结论BCGt具有预防及治疗膀胱癌的作用,且BCGt抗肿瘤作用可能是通过产生IFNγ、IL-6、NO等发挥作用的。
- 唐溯刘菊刘菊徐永革徐永革曾献武陈佩陈佩巩迪潘海龙
- 关键词:膀胱癌细胞毒性免疫应答
- 寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备被引量:1
- 2019年
- 目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。
- 何婷杨欢范凤鸣刘杰牟建超孙艳陈智代云见曾献武杨会强
- 关键词:原核表达多克隆抗体