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猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达被引量：3: 2005年; 根据PCV2 ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp)。将此基因片段克隆入pMD 18_T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD_ORF2。将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack_CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack_CMV_ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV_ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性。; 宋长绪蒋智勇王贵平高向阳赵亚华; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因重组腺病毒

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达被引量：10: 2004年; 根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。; 蒋智勇宋长绪高向阳王贵平赵亚华; 关键词：猪2型圆环病毒 ORF1基因克隆蛋白分子质量

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达被引量：10: 2004年; 应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。; 祝卫国宋长绪王贵平杨增岐黄忠李春玲王旭荣; 关键词：ORF2 广东株圆环病毒 SDS-PAGE 大肠埃希氏菌

猪圆环病毒Ⅱ型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达: 根据PCV2 ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2。将PCV2 ORF2基...; 宋长绪蒋智勇王贵平高向阳赵亚华; 关键词：重组腺病毒; 文献传递

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用被引量：27: 2004年; 根据GenBank登录的猪圆环病毒 2型 (PCV2 )的全基因组序列 ,设计了 2对引物 ,建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区 2 87个猪场的 15 6 0份样品进行了检测 ,结果 ,983份为PCV2阳性 ,阳性率为6 3%。; 王贵平蒋智勇宋长绪高向阳赵亚华林志雄朱道中; 关键词：猪圆环病毒2型套式PCR 流行病学

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析被引量：3: 2005年; 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从本室鉴定分离的PCV2GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的ORF2基因核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间。; 宋长绪赵亚华蒋智勇王贵平高向阳; 关键词：ORF2基因猪圆环病毒2型 GD GENBANK 序列同源性 PCV2

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果被引量：2: 2008年; 【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。; 祝卫国王旭荣宋长绪杨增岐王建华张春红黄忠; 关键词：ORF2基因重组腺病毒免疫效果

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广东省农业攻关项目(2003B21404)