国家自然科学基金(30572353)
- 作品数：28 被引量：117H指数：7
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- 相关机构：重庆医科大学第三军医大学遵义医学院更多>>
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- 人PPARγ1 LBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化被引量：2
- 2008年
- 目的制备高纯度的人PPARγ1LBD融合蛋白,为筛选其配体奠定基础。方法以人脂肪组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARγ1LBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化宿主菌E.coli.TB1。并对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化。结果经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,获得分子量为909bpDNA条带;当诱导剂IPTG浓度为0.4mmol.L-1,30℃振荡诱导培养6h时,重组菌TB1高效表达MBP-PPARγ1LBD融合蛋白,表达量可达胞质总蛋白的38.54%。结论成功构建了能在TB1中高效表达人PPARγ1LBD融合蛋白的重组质粒,获得了具有高生物活性的融合蛋白。
- 田蜜李苌清常伟师凌云周岐新
- 关键词：MBP
- 酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4、1A2活性的作用被引量：14
- 2008年
- 目的观察酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4、1A2活性的作用,为临床上安全有效地联合用药提供实验依据。方法采用健康成人肝细胞微粒体,分为对照组和处理组。酮康唑处理组分别加入不同浓度的酮康唑1 ml,对照组仅加入培养液,孵育15 min后再加入CYP450同工酶3A4和1A2的相应底物(分别为睾酮和非那西丁)再孵育20 min。反应终止后用高效液相色谱仪测量代谢产物(分别为6β-羟基睾酮与对乙酰氨基酚)的生成量,分别代表3A4和1A2的活性。结果细胞色素P450同工酶3A4的相对活性百分比减小到对照组50%时(IC50)酮康唑的质量浓度为0.16 mg/L。而同工酶3A4的相对活性百分比随质量浓度酮康唑增加逐渐减小,各处理组与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。低剂量细胞色素P450同工酶1A2的相对活性百分比处理组与对照组比较明显降低(P<0.05),高剂量细胞色素P450同工酶1A2的相对活性百分比处理组与对照组比较则明显升高(P<0.05)。结论酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4的活性有抑制作用,然而对细胞色素P450同工酶1A2的活性则是低剂量有抑制作用,而高剂量有诱导作用。
- 杨贵忠袁野周岐新杨俊卿刘颖菊
- 关键词：酮康唑CYP3A4CYP1A2细胞色素P450
- 鸭儿芹总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用被引量：13
- 2008年
- 目的观察鸭儿芹总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用。方法选用昆明种小鼠,鸭儿芹总黄酮(40、80、160mg/kg)三种剂量连续灌胃给药5d后,腹腔注射0.1%CCl4(10ml/kg)致小鼠急性肝损伤,测定不同剂量的鸭儿芹总黄酮对小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性,肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果3种剂量的鸭儿芹总黄酮均能显著地降低小鼠血清ALT和AST活性,升高小鼠肝脏SOD活性,降低肝脏MDA含量。结论鸭儿芹总黄酮对由四氯化碳所致的急性肝脏损伤有保护作用,其机制与提高小鼠的抗氧化能力有关。
- 田琳龚其海
- 关键词：丙氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶丙二醛
- 携带人PPARγ1受体基因高效真核表达载体的构建及其意义被引量：1
- 2007年
- 目的:构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(hPPARγ1)的真核表达载体,为hPPARγ1受体功能和基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARγ1全长基因,与经XhoI、SmaI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP,经酶切及测序鉴定重组质粒中hPPARγ1基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARγ1的表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARγ1的高效表达。结论:成功构建phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒,为基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选平台的建立及受体功能研究提供了高效表达载体。
- 章涛李苌清杨俊卿万敬员蒋建新周岐新
- 关键词：基因克隆真核表达
- 人PPARδ受体cDNA全长序列的克隆及测序
- 2007年
- 目的:对人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPAR δ基因真核表达载体及其受体功能研究奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamHI、SalI双酶切及基因测序筛选、鉴定阳性克隆pMD19-hPPARδ-T载体中hPPARa基因的完整性和忠实性。结果:经酶切和测序证实pMD19-hPPARδ-T载体中插入的hPPARδ基因序列与GeneBank中提交的序列(AY919140)一致。结论:成功克隆了hPPARδ基因,构建了pMD19-hPPARδ-T中间载体,为含hPPARδ基因真核表达载体的构建和受体功能研究打下了良好的基础。
- 章涛袁野李苌清杨俊卿周元国周岐新
- 关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体ΔCDNA克隆T载体测序
- 高效液相色谱法测定硫酸特布他林与红细胞膜表面β2肾上腺素受体结合量被引量：7
- 2010年
- 建立了高效液相色谱同时检测红细胞混悬液中硫酸特布他林与盐酸普萘洛尔的方法。红细胞与特布他林在37℃水浴振荡保温反应1h后,没有与细胞膜受体结合的特布他林通过1500r/min离心5min后分离,取上清液与受体-药物复合物分离。色谱柱为C18柱,以0.020mol/LKH2PO4溶液(含0.25%三乙胺,pH5.1)-甲醇(20∶80,V/V)为流动相,在荧光激发波长280nm,发射波长320nm处测定样品含量。在优化的条件下,特布他林与普萘洛尔在0.010～3.000mg/L范围内线性关系良好,相关系数分别为0.9999和0.9998。测定重复性相对标准偏差为0.8%和1.2%;检出限分别为1.0和3.0μg/L。该方法安全、简便、灵敏,适用于测定红细胞中硫酸特布他林和受体配体结合实验的研究。
- 蒋心惠周岐新
- 关键词：硫酸特布他林盐酸普萘洛尔红细胞膜Β2肾上腺素受体高效液相色谱
- 人PPARα受体cDNA全长序列的克隆及测序
- 2006年
- 目的对人过氧化物酶体增殖物激活受体α(hPPARα)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARα全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH I、Sal I双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性。结果经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARα基因序列与GeneBank中提交的序列(NM001001928)一致。结论成功克隆了hPPARα基因,构建了pMD19-hPPARα-T中间载体,为含hPPARα基因真核表达载体的构建奠定了基础。
- 章涛周元国陈代雄周岐新
- 关键词：CDNA克隆T载体测序
- 沙丁胺醇与红细胞膜表面β_2-肾上腺素受体结合量的高效液相色谱法测定被引量：2
- 2010年
- 建立了同时检测红细胞混悬液中沙丁胺醇（SA）与普萘洛尔（PR）含量的高效液相色谱法，并用于红细胞膜殷受体一配体结合实验研究。药物与红细胞悬液保温反应1h后，以1500r／min离心5min，将试样中游离SA和PR与含大分子的受体一药物复合物的红细胞分离，以HypersilC18柱为分析柱，10mmol／L磷酸二氢钾溶液（含0．2％三乙胺，pH5．1）-甲醇（体积比17：83）为流动相；于激发波长284nm，发射波长323nm处检测。SA在4．0～48．0μg／L范围内线性关系良好，相关系数为0．9989；PR在2．0—12．0mg／L范围内线性关系良好，相关系数为0．9998。SA与PR的RSD分别为0．85％、0．79％；检出限分别为0．18、0．30μg/L。测定结果表明，sA的非特异结合和特异结合量均随着sA加入量的增加而增大。该方法可以用于药物和受体相互作用的研究。
- 蒋心惠杨俊卿周岐新
- 关键词：沙丁胺醇普萘洛尔红细胞膜高效液相色谱
- 高效液相色谱法用于普萘洛尔与β_2肾上腺素受体结合实验研究
- 2010年
- 建立了用高效液相色谱检测红细胞混悬液中盐酸普萘洛尔的方法并用于红细胞膜β2受体-配体结合实验研究。通过1500 r/m in离心5 m in的方法将试样中游离普萘洛尔和含受体-普萘洛尔复合物的红细胞分离,采用HypersilBDS?C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm)为分析色谱柱;流动相为20 mmol/LKH2PO4溶液(其中含0.25%三乙胺,pH 5.1)?甲醇(65∶35,V/V),流速为1.0 mL/m in;276 nm波长处检测;柱温30℃;进样量20μL。普萘洛尔在5~150 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.9998。样品测定的重复性相对标准偏差为1.05%;检出限为1.5 ng/mL。样品测定结果表明普萘洛尔的特异性结合量随其加入量的增加而增大,然后达到饱和。该方法可用于受体配体结合实验的研究。
- 蒋心惠杨俊卿周岐新
- 关键词：普萘洛尔Β2肾上腺素受体高效液相色谱
- 重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立
- 2007年
- 目的:建立phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达的体系。方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000将phPPARδ-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察质粒转染细胞GFP报告基因表达强度及转染效率,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和Western Blot检测。结果:荧光显微镜下可见转染phPPARδ-IRES2-EGFP质粒的293细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因高表达,转染效率高达(85±10)%;荧光定量PCR和Western Blot检测的结果表明,phPPARδ-IRES2-EGFP转染的293细胞其hPPARδ表达水平高于空载体转染对照组(P<0.01)。结论:成功建立phPPARδ-IRES2-EGFP质粒的高效体外转染表达体系,为hPPARδ受体功能的研究及基于hPPARδ为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础。
- 章涛万敬员杨俊卿周元国周岐新
- 关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体Δ转染效率293细胞
