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牛Nanog基因真核表达载体构建及有效干扰序列筛选被引量：1: 2008年; 【目的】构建牛Nanog基因的真核表达载体pVenus-Nanog,筛选对其有效的干扰序列。【方法】以含有牛Nanog基因的PMD-18T-Nanog重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到真核表达载体pVenus上,酶切及测序鉴定正确后命名为pVenus-Nanog。将pVenus-Nanog用脂质体瞬时转染牛皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting分别检测Nanog的表达情况。针对牛Nanog基因的CDS区设计并合成3对干扰序列,分别命名为S1、S2、S3及阴性对照N.C.,用脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA于成纤维细胞,用半定量RT-PCR分析干扰效率。【结果】酶切分析与测序结果表明重组载体pVenus-Nanog构建成功,荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting结果显示其能够在牛成纤维细胞中高效表达。脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA后,半定量RT-PCR结果显示S1效果最好,干扰效率达75%,S2和S3分别为20%和70%。【结论】成功构建了牛Nanog真核表达载体pVenus-Nanog,且获高效表达。通过脂质体共转染法筛选出了牛Nanog基因的有效干扰序列,为研究该基因在胚胎干细胞及早期胚胎中维持多能性调控网络中的作用机制奠定了基础。; 云彦郑喜邦刘文强窦忠英雷安民; 关键词：NANOG基因真核表达 RNAI

豆类丝核菌次级代谢产物的急性毒性与致突变性试验被引量：4: 2007年; 通过经口急性毒性试验、小鼠骨髓微核试验和精子畸形试验对豆类丝核菌次级代谢产物的急性毒性和致突变性进行了研究.结果表明,以该代谢产物中苦马豆素的量计算,小鼠经口急性毒性试验的LD50为226.46mg/kg,LD50的95%可信限为158.49～323.59mg/kg,是治疗肿瘤剂量的14～84倍,属于实际低毒级药物.微核试验和精子畸形试验的各试验组与阴性对照组比较差异均不显著(P＞0.05),说明豆类丝核菌次级代谢产物无明显致突变性;各试验组之间比较差异均不显著(P＞0.05),说明微核的形成和精子畸形的形成与受试物无量效关系.结论:豆类丝核菌次级代谢产物是一种较安全的抗肿瘤药物.; 何欣杨鸣琦朱晓飞路宏朝云彦白慧娜琳刘磊; 关键词：豆类丝核菌苦马豆素毒性致突变性

p21基因在牛卵成熟中的表达检测及其真核表达载体构建被引量：3: 2011年; 本研究旨在检测p21基因在牛卵成熟过程中的表达,并构建其真核表达载体。首先利用RT-PCR和免疫荧光染色对不同成熟阶段牛卵内p21的mRNA和蛋白表达进行检测。然后从牛成纤维细胞中克隆了p21基因并构建pVenus-P21真核表达载体。经脂质体2000介导重组质粒pVenus-P21转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察、RT-PCR检测,确认重组质粒在Hela细胞内的表达及定位。最后应用体外转录试剂盒将p21-venus体外转录为cRNA,并注射牛卵母细胞,荧光显微镜下观察其表达及定位。结果显示,在牛卵体外成熟过程中,各时期均存在p21基因mRNA及蛋白的表达。构建的真核表达载体pVenus-P21能够在Hela细胞中正确表达及定位。p21-venus cRNA显微注射牛卵后其融合蛋白也能实现准确定位,为研究P21在卵母细胞成熟以及胚胎发育过程中的作用奠定了基础。; 赵贵民杨文琳吴苏君云彦雷安民; 关键词：牛卵母细胞 P21基因体外转录显微注射

牛Nanog基因克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达被引量：6: 2008年; 本研究克隆了牛Nanog基因,构建其真核表达载体,并转染皮肤成纤维细胞,获得能够用作核移植供核细胞的稳定转染细胞株。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Nanog基因,将其克隆到pMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pCDNA3-FLAG表达载体上,挑选序列正确的真核表达质粒pCDNA3-Nanog转染牛皮肤成纤维细胞,获得了稳定转染的细胞株。用RT-PCR和Western Blotting分别检测NanogmRNA和FLAG-Nanog融合蛋白的表达,用免疫染色法验证该细胞株是否具有干细胞特征。结果表明:(1)从胎牛原始生殖嵴中克隆了序列正确的Nanog全长编码序列;(2)所构建的pFLAG-Nanog重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中高效表达;(3)所获稳定转染的细胞株能表达ES细胞表面抗原SSEA-4和多能性维持因子Nanog、Oct-4,表明其具有一定的多能性。为进一步研究Nanog基因功能,尤其是探讨它在家畜早期胚胎发育、生产转基因动物,以及胚胎干细胞建系中的作用奠定了基础。; 郑喜邦云彦胡勇策李勇王华岩窦忠英; 关键词：NANOG 分子克隆真核表达

H1foo在牛卵成熟及核移植过程中作用的初步研究: 自Dolly诞生以来,多种哺乳动物已被成功克隆,但该技术仍然存在着克隆效率低下的问题。现在普遍认为克隆效率低是由核移植过程中受体卵母细胞对供体细胞核的不正确或不完全重编程所致,故而提高卵母细胞质量、并促进其对供体细胞核的...; 云彦; 关键词：RNAI 卵母细胞成熟重编程; 文献传递

p21基因在牛卵成熟中的表达检测及其真核表达载体构建: P21 Cip1/Wafl又名细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-1A(CDKN1A)，是最早被发现具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)作用的Cip/Kip家族成员。P21具有广泛的CDK抑制活性，通过负调控细胞周期...; 赵贵民杨文琳吴苏君云彦雷安民; 关键词：牛卵母细胞 P21基因免疫荧光染色体外转录显微注射真核表达; 文献传递

微量牛卵中H1 foo CDS序列的克隆及其mRNA向卵内显微注射被引量：8: 2009年; 本研究旨在优化从微量卵中克隆基因的条件,并构建牛H1foo基因真核表达载体。首先将微量（1~5个）卵母细胞裂解后,用改进的RT-PCR方法扩增内参β-actin基因以检测该方法扩增基因的效率,结果表明单卵扩增成功率为80%以上（10/12）,3个、5个卵扩增成功率均达100%。利用该体系从微量（5个）牛卵中克隆得到H1fooCDS全长序列,测序结果显示其与GenBank上公布序列同源性为100%。将牛H1fooCDS连接至pMD19-T载体上,经酶切、测序鉴定正确后定向亚克隆到真核表达载体pVenus上,鉴定正确后命名为pVenus-H1foo。利用脂质体2000将pVenus-H1foo转染Hela细胞,24 h后通过荧光显微镜观察、RT-PCR、Western Blotting分别检测表明其能够正确表达。将H1foo体外转录为mRNA后直接注射卵母细胞,其表达产物能准确定位于卵母细胞及极体的染色体上。结果,成功构建了牛H1foo真核表达载体pVenus-H1foo,为研究该基因在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础。; 云彦吴苏君隋进强胡勇策雷安民; 关键词：RT-PCR 体外转录

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云彦