高雪峰
- 作品数：9 被引量：16H指数：2
- 供职机构：兰州生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 重组人睫状神经营养因子突变体的构建、表达及生物活性分析被引量：6
- 2007年
- 目的:通过对原始CNTF的突变改造,降低表达蛋白的免疫原性,同时增加其稳定性,以期能用于临床治疗肥胖症。方法:以原始CNTF为模板,去掉N端的12个氨基酸、C端的14个氨基酸,并将C端末2个氨基酸点突变为极性较强的赖氨酸,在大肠杆菌中表达,获得CNTF-T突变体。结果:基因序列分析与原设计吻合,目的蛋白表达量占全菌体的35%左右,表达蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性、DEAE-FF纯化,纯度可达95%以上,小鼠体内生物活性测定,能明显抑制小鼠体重增长,且CNTF-T的生物活性比原始序列CNTF的活性高。结论:突变的CNTF-T有望成为新一代的生物减肥制剂应用于临床。
- 应莲芳雷清梁凌宇高雪峰蒋琳
- 关键词：突变体生物活性减肥
- 重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰被引量：2
- 2014年
- 目的:研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)突变体的聚乙二醇(PEG)化修饰,对rhCNTF的PEG化产物进行初步分离纯化及相关生物活性检测。方法:采用分子生物学技术经点突变得到rhCNTF的突变体CN10,通过实验设计研究CN10的最佳PEG化条件;采用分子筛层析方式对偶联产物进行初步纯化,最后用ELISA和小鼠体重增长抑制法检测PEG化后的CN10蛋白的生物活性。结果:能运用mPEG-MAL对CN10进行定点修饰,PEG化后用Superdex200能够分离CN10;PEG化后的CN10每2 d腹腔注射1次,对小鼠体重的增长抑制率可达50%,与rhCNTF每天注射2次的体重增长抑制作用相当。结论:CN10蛋白在PEG化修饰后,其减重效应持续时间明显延长。
- 梁凌宇雷清高雪峰杨军应莲芳蒋琳
- 关键词：人睫状神经营养因子纯化
- 重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化
- 目的：建立从高表达重组戊型肝炎病毒抗原的工程菌发酵和目的蛋白纯化的工艺。
方法：在三角烧瓶中，探讨了不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10升发酵罐中，探讨了诱导时间、补料方式、溶氧量对...
- 应莲芳梁凌宇杨军高雪峰蒋琳
- 关键词：戊型肝炎病毒抗原工程菌蛋白纯化生物制品
- 文献传递
- 重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化
- 2007年
- 目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。
- 应莲芳梁凌宇杨军高雪峰蒋琳
- 关键词：工程菌发酵纯化
- 基因工程菌发酵液中多种成分快速检测方法的建立被引量：4
- 2013年
- 目的 建立一种快速检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇和乙酸含量的方法。方法 采用HPLC法检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量：使用AminexHPX-87H column（300 mm×7.8 mm,9μm）,以5 mmol/L H2SO4溶液作为流动相,在柱温35℃、流速0.60 ml/min的条件下,用示差折光检测器进行检测,采用外标法定量。对方法进行系统适用性、专属性、检测限、定量限、线性范围、准确性、精密性验证及初步应用。结果各物质色谱峰理论塔板数均大于8 500,各峰之间的分离度均大于4.5,阴性对照在相应位置处未见色谱峰;在标准曲线线性范围内,乙酸、葡萄糖、甘油、甲醇浓度与峰面积均呈良好的线性关系,相关系数在0.999 97～0.999 98之间;该方法检测葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的平均加样回收率分别为102.18%、103.84%、105.16%、102.82%;该方法重复6次检测发酵液,其中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸峰面积的RSD分别为0.15%、0.21%、0.23%、0.23%。该方法对重组大肠埃希菌和毕赤酵母发酵过程中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量进行检测,结果能够满足发酵操作的要求。结论 建立的HPLC法系统适用性和专属性良好,加样回收率和精密性较高,不受培养基中蛋白胨、酵母粉和其他代谢产物的影响,可应用于基因工程菌发酵过程中3种碳源和乙酸含量的检测。
- 杨军梁凌宇高雪峰周晖国蒋琳
- 关键词：高效液相色谱法发酵液碳源乙酸
- 凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子中细菌内毒素含量被引量：2
- 2013年
- 目的采用凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子(CNTF)中细菌内毒素含量,控制制品质量,消除临床热原反应的发生。方法供试品参照《中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法和动态浊度法要求进行检查。结果注射用重组人睫状神经营养因子溶液在100μg/mL质量浓度下,确定内毒素限值为10 EU/mL。凝胶法和动态浊度法检查后,注射用重组人睫状神经营养因子内毒素含量均符合规定。结论凝胶法和动态浊度法可用于注射用重组人睫状神经营养因子的细菌内毒素检查。
- 杨军应莲芳蒋琳高雪峰
- 关键词：细菌内毒素检查凝胶法浊度法
- 重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立
- 2011年
- 采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。
- 马亚茹陆俭李萍高雪峰蒋琳
- 关键词：双抗体夹心ELISA法
- SEC-HPLC法测定CN_(10)冻干品中CN_(10)的蛋白含量被引量：2
- 2014年
- 通过高效液相色谱法(HPLC)建立一种测定CN10冻干品中蛋白含量的方法。以0.1 mol/L TrisHCl、0.1 moL/L NaCl、pH 7.2缓冲液作为流动相,色谱柱为TSK2000SWxl(4.6 mm×250 mm)凝胶过滤色谱柱,体积流量为0.65 mL/min,进样体积50μL,检测波长选择280 nm,依据HPLC外标法原理建立CN10含量测定方法,并根据《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》对方法进行相关验证。结果:在该条件下,CN10和人血白蛋白之间有良好的分离度,CN10浓度在0.1~0.6 mg/mL的范围内与其峰面积呈良好的线形关系(R2=0.998 1),最低检出限和最低定量限分别0.01 mg/mL和0.04 mg/mL。方法的重复性RSD(%)为0.38,平均回收率为(100.40±2.28)%。用该方法检测CN10冻干制剂中的CN10蛋白含量时,不受人血白蛋白的影响,具有较高的准确性和专属性。
- 梁凌宇高雪峰应莲芳张轶杨军蒋琳
- 关键词：冻干品外标法CNTF人血白蛋白
- 从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法
- 本发明涉及一种从基因重组表达的蛋白中分离出异构蛋白的方法。本发明的方法是将收集的湿菌体在洗涤缓冲液制成菌体混悬液，经超声破碎离心，弃去上清，沉淀用含尿素、TritonX－100的TE缓冲液洗涤得到表达蛋白包涵体，再用含盐...
- 蒋琳应莲芳谢溱高雪峰梁凌宇李萍卜晓萍马亚茹
- 文献传递
