顾银良
- 作品数：13 被引量：39H指数：4
- 供职机构：复旦大学上海医学院分子医学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市重大科技攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 可溶性组织因子的基因克隆、表达与性质研究被引量：5
- 2002年
- 组织因子是外源性凝血途径的启动因子,为膜受体蛋白,胞外区的促凝血功能几乎与完整分子相同,因此采用重组DNA技术制备组织因子的胞外区分子,并对其活性进行研究,以便替代兔脑粉用于PT检测。以人胎盘总RNA为模板,用RT-PCR扩增组织因子胞外区cDNA基因,经序列分析证实后在大肠杆菌中表达,产物形成包涵体。表达产物经复性、离子交换和凝胶过滤色谱纯化后与磷脂结合,进行促凝血试验。结果表明在磷脂存在下,可溶性TF有明显的促凝血活性,可以取代兔脑粉用于PT检测。
- 于敏王羽雄顾银良宋后燕
- 关键词：基因克隆包涵体基因表达血液凝固
- 人源性组织因子在SP2/0细胞中的初步表达被引量：2
- 2009年
- 构建组织因子表达质粒并转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,分泌表达有活性的组织因子。用阳离子聚合物法将构建好的转染质粒pIRESneo3-TF1-218转染入SP2/0细胞,经G418抗性筛选后,蛋白可由SP2/0细胞无血清培养分泌表达。G418 800ug/ml筛选到的表达克隆,经无血清培养,可分泌表达,western blot证明其为人组织因子衍生物,Mr为40k,脂化后,具有促凝血活性。成功构建组织因子蛋白表达质粒pIRESneo3-TF1-218。
- 王羽雄马春姑顾银良宋后燕于敏
- 关键词：稳定转染凝血酶原时间
- 人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化被引量：4
- 2008年
- 目的制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor,r-TF）用于构建PT试剂盒。方法将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组,构建酵母表达质粒pPIC9K-TF,利用电穿孔法转化宿主菌Pichia pastorisGS115,转化子经G418抗性筛选后,获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导,表达r-TF,表达产物经纯化后,鉴定生物活性。结果SDS-PAGE证实表达产物的分子量为37 000～45 000,Western blot证明其为人组织因子衍生物,纯化后,r-TF经脂化后,具有促凝血活性,为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究TF的构效关系创造条件。结论用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF,表达量达到182 mg/L。纯化工艺简便易行,蛋白回收率高,纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。
- 王羽雄于敏顾银良宋后燕
- 关键词：毕赤酵母凝血酶原时间
- 一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用
- 本发明属生物技术领域，具体涉及一种兼具抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性的双功能水蛭素(Bifunctional RecombinantHirudin)的蛋白质结构和制备方法及其应用。根据对野生型水蛭素的结构及其生化特性的分...
- 宋后燕汤其群管瀚俊莫炜顾银良
- 文献传递
- 基因工程链激酶的中试研究被引量：3
- 1996年
- 链激酶是急性心肌梗塞溶栓治疗的特效药物。我们利用基因工程方法在大肠杆菌中高效表达重组链激酶，用１０Ｌ发酵罐对工程菌进行高密度、高表达发酵，通过简便的复性和纯化流程，一次能够获得纯度达９８％以上、比活性９～１０万ＩＵ／ｍｇ的ｒ－ＳＫ，可分装３００～４００个剂量静脉注射用ｒ－ＳＫ冻干粉制剂。形成了中试规模的批量生产能力。
- 任军黄阳滨汤其群吴晓俐涂宣林顾银良朱运松宋后燕
- 关键词：基因工程链激酶中试心肌梗塞溶栓疗法
- 人肝细胞生长因子cDNA的克隆及其在Pichia系统中的表达被引量：1
- 1997年
- 采用 RT- PCR方法以胎肝 m RNA为模板克隆人肝细胞生长因子全长 c DNA,核苷酸序列分析证实比文献报道多 2个氨基酸编码序列。经与 Pichia分泌型表达载体 p PIC9重组 ,表达质粒转化 GS115细胞 ,mut+ 表型筛选 ,经甲醇诱导实现了 h HGF在 Pichia Pastoris酵母系统中分泌型表达 ,SDS- PAGE电泳 ,银染法分析证实表达产物分子量为 80～ 85KD左右 ,具有刺激肝细胞增殖活性。
- 李孝圭顾银良朱运松宋后燕
- 关键词：肝细胞生长因子CDNADNA克隆PICHIA酵母
- 重组人HBNF的表达和提纯及其生物活性的测定被引量：1
- 2003年
- 目的 通过酵母表达系统表达重组人亲肝素性促轴突生长因子 (heparin bindingneuritepromotingfac tor ,HBNF)蛋白并检测其生物活性。方法 将重组表达质粒pPIC9k/HBNF通过电穿孔法转入酵母表达系统GS115 ,利用G4 18筛选高拷贝子用于大量表达HBNF蛋白 ,再检测其生物活性。结果 通过G4 18筛选出抗性大于 2mg/mL的高拷贝子 ,大量表达、提纯后获得相对分子质量约 180 0 0蛋白 ,Western blot证实为HBNF蛋白 ,生物活性检测显示提纯HBNF有显著的神经营养作用。结论 通过酵母表达系统获得的重组人HBNF有一定的生物活性。
- 周强彭裕文顾银良汪洋宋后燕
- 关键词：基因表达提纯生物活性酵母表达系统
- 一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用
- 本发明属生物技术领域,具体涉及一种兼具抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性的双功能水蛭素(BifunctionalRecombinantHirudin)的蛋白质结构和制备方法及其应用。根据对野生型水蛭素的结构及其生化特性的分析...
- 宋后燕汤其群管瀚俊莫炜顾银良
- 文献传递
- 重组双功能水蛭素的发酵、纯化和鉴定
- 本实验室构建了重组双功能水蛭素(Recombinant-RGD-Himdin,r-RGD-Hirudin)cDNA的表达质粒 r-RGD-Hirudin-pPIC9K,转化毕赤酵母,经筛选得到高表达阳性克隆,PCR鉴定为...
- 莫炜张艳玲王龙生杨新英顾银良宋后燕
- 文献传递
- 重组TFPI缺失突变体TFPI_(1-161)在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定被引量：2
- 2004年
- 人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI1 - 1 6 1 仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒pGEM 3Zf( ) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI1 - 1 6 1 基因 ,构建表达质粒pPIC9K TFPI1 - 1 6 1 并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI1 - 1 6 1 ,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 2 0倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI1 - 1 6 1 表达为TFPI1 - 1 6 1 (2 4kD)和TFPI1 - 1 6 1 (2 7kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4 8和 4 9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1 4gTFPI1 - 1 6 1 (2 4kD)和 1 8gTFPI1 - 1 6 1 (2 7kD) ,其比活性分别达 12 880u mg和 12 4 0 0u mg ,回收率达 5 5 %。经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测 ,重组TFPI1 - 1 6 1 具有良好的抗凝及抑制FXa活性的作用。为获得大量TFPI1 - 1 6 1 提供了一种廉价高效的蛋白表达纯化方式 。
- 白浩马端宋后燕莫炜顾银良孔德升郭泓珅
- 关键词：组织因子途径抑制物PICHIAPASTORIS
