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CD133多克隆抗体制备及肿瘤干细胞鉴定: 2011年; 目的制备肿瘤干细胞标志性蛋白CD133的多克隆抗体,为进一步研究肿瘤组织中肿瘤干细胞的生物学特性以及筛选肿瘤干细胞、制备肿瘤干细胞的小鼠模型奠定基础。方法以人CD133蛋白细胞外膜表面肽段为抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,进而用其对肿瘤组织进行Western blot以及免疫组化染色。结果 Western blot证实该抗体可以识别过表达的myc-CD133以及内源性CD133,进一步免疫组化结果显示该抗体可以识别恶性胶质瘤中的肿瘤干细胞。结论成功制备高效、特异的CD133多克隆抗体,该抗体可以用于肿瘤组织的免疫染色及肿瘤干细胞的筛选。; 田军龙蔡佩玲夏孝强李芳华王德华陈米娜; 关键词：肿瘤干细胞 CD133 多克隆抗体

即时定量PCR法和等位基因特异性寡核苷酸PCR法检测肺腺癌EGFR基因第21号外显子L858R突变的对比性研究被引量：2: 2011年; 自从Lynch等和Paez等发现肺癌细胞中上皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶编码区基因突变以来，研究证明具有EGFR基因第19号外显子（del746-A750）缺失突变或第21号外显子L858R错义突变的肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼进行分子靶向治疗的有效率高达80％以上，而对于缺乏EGFR突变的患者采用上述治疗则基本无效。; 董丹丹刘卫平唐源邹艳曹梅李芳华; 关键词：EGFR基因定量PCR法等位基因特异性酪氨酸激酶抑制剂肺腺癌

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定: 2009年; 目的获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体。方法RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化。SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性。结果成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体。Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合。结论成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础。; 夏孝强陈米娜李芳华蔡佩玲; 关键词：融合蛋白多克隆抗体

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定: 2008年; 目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。; 余守洋陈米娜季一飞夏孝强李芳华王德华崔义元; 关键词：真核表达原核表达蛋白纯化多克隆抗体

Rheb1基因多克隆抗体的制备: 2008年; 目的:在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST-Rheb1融合蛋白,以之免疫成年新西兰大白兔,获得Rheb1多克隆抗体。方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有Rheb1基因的真核和原核表达载体;IPTG诱导GST融合蛋白高表达,通过皮下注射免疫新西兰大白兔,并取血清进行免疫印记分析抗体效价。结果:成功的制备了高效价的Rheb1兔多克隆抗体。结论:Rheb1多克隆抗体的成功制备,将为研究Rheb1基因的功能发挥重要的作用。; 罗茂文杜晓霞李芳华陈米娜夏孝强; 关键词：多克隆抗体融合蛋白

利用酵母双杂交研究与Ca^(2+)CRAC通道Orail相互作用蛋白: 2008年; 目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orail发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制。方法:以Orail-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用。结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析,发现了其中一个感兴趣的蛋白。结论:Orail可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关。; 夏孝强李芳华季一飞余守洋田军龙; 关键词：酵母双杂交蛋白相互作用

基于CA杂合启动子基因敲入载体的构建: 2008年; 目的:改造原有的Rosa26基因敲入系统,引入启动能力更强的CA杂合启动子(由鸡actin启动子和SV40增强子融合而成)。方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有CA启动子的基因敲入载体。结果:成功地对原有Rosa26基因敲入系统进行了改造,引入了CA启动子,并且成功构建了mGluR5基因敲入载体。结论:基于CA杂合启动子的基因敲入载体具有更强的启动能力,而且能够在某些特定组织中增强目的基因的表达,为今后研究基因功能及疾病模型小鼠的制备奠定了良好基础。; 崔义元陈米娜王德华李芳华; 关键词：MGLUR5

Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用: 2009年; 目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白。SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定。结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml。抗Orai2多抗抗体效价达1∶10 000。能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应。同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Orai2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低。结论:成功表达并纯化了GST-Orai2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Orai2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Orai2蛋白,能对Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础。; 夏孝强崔义元李芳华陈米娜; 关键词：多克隆抗体过表达内源性

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