杨磊
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 供职机构：江苏科技大学生物与环境工程学院更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用被引量：2
- 2020年
- 根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10^4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10^2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。
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- 关键词：灵敏度
- 桑树皱叶病毒NASH检测方法的建立及应用被引量：3
- 2018年
- 以非放射性物质地高辛为标记物,采用随机引物标记法获得了灵敏度高、特异性强的DNA探针,通过优化杂交时间以及上样量,建立了桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)的核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)检测体系。与PCR检测方法相比,建立的NASH检测体系准确率达93.1%。利用建立的NASH技术对江苏省镇江市3个不同地块(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)采集的60个桑叶样品进行检测以分析MCLV病毒在该地区的分布情况及与桑树病毒样病害的关系,结果显示,Ⅰ地块检出率20%,Ⅱ地块检出率90%,Ⅲ地块检出率95%,平均检出率68.3%,说明MCLV在该地区分布广泛;另外,在某些无任何病毒病症状的植株上检出MCLV,而在某些有明显花叶或萎缩症状的植株上未检测出MCLV,说明MCLV可能与桑树的花叶或萎缩症状无明显关联。
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- 关键词：核酸斑点杂交症状
- 桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用被引量：3
- 2017年
- 桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因(cp)序列中含有较多大肠埃希菌(Escherichia mori)BL21(DE3)的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显著提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。
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- 关键词：外壳蛋白基因稀有密码子原核表达抗血清
- 黄瓜花叶病毒RNA3基因间隔区的功能研究被引量：1
- 2020年
- 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是RNA病毒基因组功能研究的重要模式种,其各个开放阅读框及顺式作用元件的功能已较为清楚,但还缺乏RNA3基因间隔区的功能在植物体水平上的相关研究。本研究采用基因合成和双酶切的方法构建了基因间隔区(Intergenic region,IGR)3’UTR、5’UTR和全序列的缺失突变体侵染性克隆(简称pΔ3’UTR,pΔ5’UTR和pΔAll),并结合农杆菌介导的瞬时表达分析了IGR的功能。接种结果显示,注射pΔ3’UTR侵染性克隆的本氏烟表现出与注射野生型(Wild type,Wt)的本氏烟相似的症状,但要比Wt晚3.5d,而注射pΔ5’UTR、pΔAll的本氏烟没有表现任何症状,直至枯萎。Western Blot结果显示,注射突变体的本氏烟中,只有注射pΔ3’UTR的本氏烟在出现症状后可被检测到外壳蛋白(Coat protein,CP),但远低于Wt中的CP表达量,说明IGR 3’UTR缺失使最终翻译出来的外壳蛋白水平明显降低;Northern Blot结果显示,也只有注射pΔ3’UTR的本氏烟在出现症状后表达了RNA3和RNA4,但表达量始终低于野生型。针对接种叶内RNA3的半定量RT-PCR结果显示,注射Wt、pΔ3’UTR的本氏烟的预期条带亮度都很高,说明RNA3在缺失IGR 3’端序列时仍能正常转录且能正常复制;而注射pΔ5’UTR、pΔAll的本氏烟的预期条带亮度都很低,说明RNA3在缺失IGR 5’端序列或缺失IGR全部序列时,cDNA仍能转录出少量的RNA3,但这些RNA3完全丧失了复制能力。本研究揭示IGR5’UTR含有RNA3复制的必要元件,其缺失将使病毒完全失去复制能力;IGR 3’UTR控制着RNA3复制的效率,其缺失导致RNA3的积累量显著降低;IGR 3’UTR缺失时病毒只翻译出少量的CP,但也使寄主产生严重的症状。
- 杨磊张建平孙鑫卢全有
