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肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析被引量：2: 2015年; 目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。; 孙勇勒娟潘晓峰张方; 关键词：肠三叶因子荧光素酶报告基因启动子

壳聚糖-肠三叶因子纳米粒制备与体外转染的实验研究: 2014年; 目的:构建hITF基因传递系统,检测其细胞转染效果。方法:首先构建肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)的真核表达载体,再利用复凝法制备壳聚糖纳米粒,用透射电镜观察纳米粒的形态及大小,并利用HEK293细胞检验纳米粒的转染能力,最后利用RT-PCR和Western blot检测目的基因的转录及表达情况。结果:成功构建出hITF真核表达载体,利用复凝法制备了不同N/P比的壳聚糖纳米粒,透射电镜观察到粒度<1 000 nm,粒径呈窄分布;荧光显微镜及流式细胞仪检测显示,壳聚糖纳米粒对HEK293细胞的转染率约为80%,和脂质体的转染率基本一致;RT-PCR和Western blot检测说明hITF被成功转录并分泌表达。结论:成功构建了hITF理想的基因传递系统,为壳聚糖介导hITF基因治疗的应用打下基础。; 孙勇王良喜孙曙光毛学飞邓向东潘晓峰张方陈宝君勒娟; 关键词：壳聚糖基因治疗转染

腺病毒介导人肠三叶因子基因对肠上皮细胞的影响被引量：2: 2015年; 目的构建含有人肠三叶因子（hITF）基因的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的影响.方法首先构建重组腺病毒载体,并感染人肠上皮细胞株Caco-2;然后行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测,从mNRA及蛋白水平检测hITF表达;感染病毒细胞做爬片后行细胞免疫荧光检查;最后通过划痕实验,检测重组腺病毒对肠上皮细胞迁移功能的影响.结果成功构建出重组腺病毒,可以感染人肠上皮细胞株Caco-2,感染效率接近100％;RT-PCR和Western blot检测证实,hITF被成功转录并分泌表达;细胞免疫荧光显示,hITF可表达于细胞核和细胞质,但以细胞质为主;划痕实验证明感染重组腺病毒对肠上皮细胞具有很强的促迁移能力,重组腺病毒组迁移距离为（216.67±16.43） μm,显著高于空载病毒组的（68.00±8.37） μm和对照组的（68.00±8.37）μm.结论成功构建了含hITF基因的腺病毒载体,该载体对肠上皮细胞具有促迁移作用,为hITF基因治疗的应用打下基础.; 孙勇勒娟陈宝君潘晓峰张方; 关键词：肠三叶因子腺病毒肠上皮细胞迁移

基因重组hTFF3治疗烧伤小鼠肠黏膜损伤的实验研究: 目的：观察基因重组hTFF3对严重烧伤所致肠黏膜损害的治疗作用.方法：采用30％体表面积Ⅲ度烧伤大鼠模型,随机分成对照(C)组、烧伤对照(B)组和烧伤后hTFF3治疗(TFF3)组,TFF3组伤后1小时开始灌胃hTFF3...; 孙勇王良喜毛学飞邓向东潘晓峰吴杭庆张方; 关键词：三叶因子3 烧伤肠黏膜

基因重组肠三叶因子对肠上皮细胞修复和保护作用的研究被引量：1: 2014年; 目的：探讨基因重组肠三叶因子（ITF）对肠上皮细胞（IEC-6）是否具有促进修复和保护的作用。方法：制备不同浓度的重组ITF。首先,采用MTT法观察ITF对IEC-6细胞增殖活性的影响;其次,制作IEC-6细胞机械损伤模型,观察ITF对IEC-6细胞移行速率的影响;最后,采用烧伤血清致IEC-6细胞损伤模型,观察ITF对IEC-6细胞的保护作用。结果：各种浓度的ITF对IEC-6细胞具有一定的促增殖作用,但差异无统计学意义（P=0.19）。ITF可加快IEC-6细胞移行速度,是对照组的2-3倍（P〈0.01）。ITF可明显降低烧伤血清致IEC-6细胞损伤程度,反映细胞损伤的谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）活性显著下降,且作用持续12 h。联合使用黏蛋白（Mucin）可显著加强ITF的细胞保护作用,谷丙转氨酶（ALT）、AST、LDH活性显著降低,且保护作用延长至48 h（P〈0.01）。结论：ITF可加快细胞移行速度,促进受损肠黏膜屏障的重建,对肠上皮细胞具有明显的保护作用。单独使用ITF对细胞增殖影响不明显,与Mucin联合使用,其保护作用明显增强。; 王良喜孙曙光毛学飞邓向东潘晓峰张方孙勇; 关键词：肠三叶因子肠上皮细胞迁移

含hITF基因cDNA的腺病毒载体的构建及其感染肠上皮细胞的研究: 2014年; 目的构建含有人肠三叶因子基因cDNA的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的感染能力。方法利用PCR技术扩增hITF基因cDNA全长序列,测序后亚克隆至腺病毒穿梭质粒,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1大肠杆菌株BJ5183感受态细胞中进行同源重组,内切酶PmeⅠ线性化后转染HEK293细胞进行病毒包装及扩增,并进行滴度测定。将重组腺病毒感染肠上皮细胞(HT-29),荧光显微镜观察感染效果。结果成功构建出重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,PacⅠ酶切鉴定后命名为Ad-hITF;重组腺病毒载体在HEK293细胞中包装,获得重组腺病毒颗粒;根据Karbers公式计算病毒颗粒滴度为2×109 pfu/mL;重组腺病毒可以感染肠上皮细胞(HT-29),感染效率较高。结论成功构建含hITF基因cDNA的重组腺病毒载体并获得大量子代重组腺病毒,为腺病毒介导hITF基因治疗的应用打下基础。; 孙勇陈宝君勒娟潘晓峰张方; 关键词：肠三叶因子腺病毒肠上皮细胞基因治疗

人三叶因子3对烧伤小鼠胃黏膜的保护作用研究被引量：5: 2013年; 目的观察基因重组人三叶因子3(hTFF3)对严重烧伤所致胃黏膜损害的保护作用。方法采用30%体表面积Ⅲ°烧伤小鼠作为模型。将小鼠随机分成正常对照(A)组、烧伤对照(B)组和hTFF3治疗(C)组,C组伤后1 h开始灌胃hTFF3,剂量为1 mg/kg,B组灌胃等量生理盐水,各组每天灌胃1次,连续5 d。观察烧伤后胃黏膜损伤指数、胃黏膜大体形态学改变、病理学改变,以及病死率。结果烧伤小鼠每天给予1 mg/kg的hTFF3灌胃,胃肠黏膜受损程度显著降低,胃黏膜病理改变明显减轻,B组以出血、坏死和溃疡为主,C组以充血、水肿为主,小鼠5 d病死率有所下降(27.3%、45.6%)。结论重组hTFF3对烧伤后胃肠道损伤具有明显的治疗作用,能促进受损黏膜屏障的重建。; 孙勇王良喜毛学飞邓向东潘晓峰吴杭庆张盼张方; 关键词：三叶因子3 烧伤胃黏膜

壳聚糖纳米粒作为肠三叶因子基因传递载体的实验研究: 2014年; 目的构建理想的人肠三叶因子(human intestinal trefoil factor,hITF)基因传递系统。方法利用复凝法制备载基因壳聚糖纳米粒,用透射电镜观察纳米粒的形态及大小,以Zeta电位仪检测不同N/P比及不同pH对制备的载基因纳米粒Zeta电位的影响,琼脂糖凝胶电泳分析纳米粒对基因的包载能力,高速离心法测定纳米粒的包封率和载药量,分析纳米粒中基因的体外释放过程,最后检测纳米粒在HEK293细胞中的转染效率。结果利用复凝法制备了不同N/P比的壳聚糖纳米粒,透射电镜显示粒径小于1 000 nm,粒径呈窄分布;Zeta电位与N/P比呈正相关,而与pH值呈负相关;凝胶阻滞实验说明壳聚糖在N/P比大于1时可以完全包裹质粒;包封率随着N/P比的增加而增加,载药量则随着N/P比的增加而减小;体外释放实验显示,纳米粒释放速度先快后慢,并且随着N/P比的增加而逐渐减慢;壳聚糖纳米粒对HEK293细胞的转染率超过50%。结论成功构建了理想的hITF基因传递系统,为壳聚糖介导hITF基因治疗的应用打下基础。; 孙勇王良喜孙曙光毛学飞邓向东潘晓峰张方; 关键词：壳聚糖基因治疗

基因重组人三叶因子3治疗烧伤小鼠肠黏膜损伤的实验研究被引量：2: 2014年; 目的观察基因重组hTFF3对严重烧伤所致肠黏膜损害的治疗作用。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,随机分成对照组、烧伤组和烧伤后hTFF3治疗(TFF3)组,TFF3组伤后1 h开始hTFF3灌胃,剂量为1 mg/kg,烧伤组和对照组灌胃等量生理盐水,各组每天灌胃1次,连续5 d。观察烧伤后肠组织病理学改变,肠黏膜肠绒毛高度、隐窝深度及病死率。结果烧伤小鼠每天给予1 mg/kg的hTFF3灌胃,显著降低肠黏膜受损程度,肠黏膜病理改变明显减轻,烧伤组以出血、坏死和溃疡为主,TFF3组以充血、水肿为主,同时肠黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度明显增加,小鼠5 d病死率有所下降(27.3%vs 45.6%)。结论重组hTFF3对烧伤后肠道损伤具有明显的治疗作用,能促进受损黏膜屏障的重建。; 孙勇王良喜毛学飞邓向东潘晓峰吴杭庆张方; 关键词：三叶因子3 烧伤肠黏膜小鼠

ITF通过JAK-STAT3途径上调自身启动子的活性: 2014年; 目的:研究肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)对自身启动子活性的影响及Janus激酶/信号转导和转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信号通路对其的调控作用。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR获取ITF基因5'侧翼序列,插入p GL3-Basic载体,构建ITF启动子重组载体;以不同浓度的ITF刺激,检测双荧光素酶的活性;运用JAK-STAT3通路特异性抑制剂AG490阻断JAKSTAT3信号通路,观察AG490对ITF启动子活性的影响。结果:酶切和直接测序法证实包含ITF启动子的重组质粒构建成功;瞬时转染实验显示,ITF能显著提高ITF启动子的活性(P<0.05);加入AG490后ITF启动子活性显著下降(P<0.05)。结论:ITF通过JAK-STAT3途径上调自身启动子的活性。; 孙勇勒娟陈宝君潘晓峰张方; 关键词：肠三叶因子启动子

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张方

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